邵天瑞，史翠娟，吳深濤

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381)

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，其中超過90%的糖尿病為2型糖尿病，大血管系統(tǒng)(心血管疾病)和微血管系統(tǒng)(糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)病變)并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族/β-連環(huán)蛋白(wingless type MMTV integration site family/β-catenin,Wnt/β-catenin)信號(hào)通路在糖尿病腎損傷中起著關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞的損傷，Wnt信號(hào)也參與了腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展[3]，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，抑制腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程，可最終發(fā)揮腎臟保護(hù)的作用[4]。目前西醫(yī)治療糖尿病及其并發(fā)癥的手段有限，而以辨證論治為主、注重癥狀改善的中醫(yī)藥療法對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療具有明顯優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)的結(jié)合，以及生化指標(biāo)的使用，將為糖尿病患者提供更合理的治療方法，同時(shí)減少其并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[5]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是中醫(yī)治療缺血性損傷的傳統(tǒng)名方[6]。一項(xiàng)Meta分析顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療早期糖尿病腎病臨床療效更好，具有明顯保護(hù)腎臟功能的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病大鼠腎組織病理變化及Wnt蛋白表達(dá)的影響，以探討其對(duì)腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠120只，體重(170±10)g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(津)2021-0003。飼養(yǎng)于天津易生源動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度(50±10)%，噪聲不超過85分貝，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水和飲食，并保證每日更換墊料1次。

1.2藥物及主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma，批號(hào)：S0130)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷劑XAV-939(MCE，批號(hào)：Lot:79157)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯(黃芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、當(dāng)歸9 g、地龍9 g、桃仁9 g、紅花9 g，藥物由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院南院國(guó)醫(yī)堂提供，中藥房代煎后4 ℃保存?zhèn)溆?；檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.5)；Wnt4(EterLife EL611043)、Wnt5a(EterLife EL611044)、β-catenin(EterLife EL601047)、GAPDH(EterLife EL800402)抗體及相應(yīng)二抗(索萊寶SE134)；血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒[佰思諾(天津)生物科技有限公司]；HE染液套裝[佰思諾(天津)生物科技有限公司]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇20只作為空白組，予以普通飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。其余100只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，之后一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg建立糖尿病模型，1周后空腹血糖(FPG)大于16.7 mmol/L表示糖尿病模型構(gòu)建成功。造模過程中，大鼠死亡11只，血糖小于16.7 mmol/L的2只大鼠予以剔除，3只大鼠成模后即處死用于觀察腎臟病變狀態(tài)，將模型構(gòu)建余下的84只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、阻斷劑組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組，每組21只。阻斷劑組大鼠給予XAV-939腹腔注射，5 mg/(kg·周)，連續(xù)4周；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃，補(bǔ)陽(yáng)還五湯整方藥量111 g/d，按照人體重60 kg換算給藥劑量，大鼠與人之間換算系數(shù)為6.25，大鼠用藥量為6.25×111 g/60 kg=11.544 g/kg，為方便計(jì)算取劑量為11.5 g/(kg·d)，每日1次，連續(xù)4周；補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃及XAV-939腹腔注射，劑量及方法同阻斷劑組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組；空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4觀察指標(biāo)及方法 ①稱量各組大鼠干預(yù)4周末體重。②干預(yù)4周末腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)FPG、SCr和BUN水平。③采血后，大鼠在麻醉狀態(tài)下處死，取腎臟組織，用生理鹽水沖洗、稱重，計(jì)算腎臟指數(shù)(腎臟指數(shù)=腎組織重量/體重)。④取大鼠其中一側(cè)腎臟進(jìn)行組織切片，采用蘇木素-伊紅染色(HE)法光鏡下觀察腎臟病理變化。 ⑤取大鼠另一側(cè)腎臟，Western blot法檢測(cè)腎臟組織中Wnt4、Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)量：將腎組織從-80 ℃的冰箱中取出，先稱量然后剪碎，放入1.5 mL離心管中，每100 mg組織加入裂解液1 mL、PMSF 10 μL，用玻璃勻漿機(jī)裂解，離心5 min，收取上清即為總蛋白溶液，BCA法測(cè)蛋白濃度。電泳槽內(nèi)放入蛋白預(yù)制膠，其次加電泳液，最后上樣，進(jìn)行電泳，在溴酚藍(lán)跑出后，停止電泳。隨后根據(jù)分子量切割膠體，在電轉(zhuǎn)液中，按照正極-負(fù)極方向疊放海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、海綿，將電泳槽放入冰盒中，時(shí)間比分子量多轉(zhuǎn)1 min。封閉在孵育盒中進(jìn)行，將封閉液倒入盒中，每格子10 mL，搖床speed 50，2 h。加入經(jīng)TBST稀釋后的β-catenin抗體(1∶500)、WNT5A抗體(1∶500)、WNT4抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1 000)，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。TBST溶液漂洗5 min，重復(fù)4次。加入經(jīng)TBST稀釋后的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。將PVDF膜放入ECLA、ECLB等體積混合液體中1～2 min后取出，將殘液擦凈，置于暗匣曝光，最后進(jìn)行顯影、定影。膠片掃描、存檔，進(jìn)行顏色處理，測(cè)定灰度值。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組大鼠存活情況 給藥前空白組大鼠20只，模型組及給藥3組大鼠各21只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠因高血糖狀態(tài)死亡2只，阻斷劑組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和大補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠分別死亡5只、6只、8只，1～3周每周各組分別取材3只，用于另一對(duì)照實(shí)驗(yàn)中。故至第4周時(shí)，每組分別剩余8只、7只、7只、6只、4只大鼠。

2.2各組大鼠體重、血糖及腎臟指標(biāo)比較 干預(yù)4周后，模型組大鼠體重明顯低于空白組(P<0.05)，F(xiàn)PG、BUN水平和腎臟指數(shù)均明顯高于空白組(P均<0.05)，血清SCr水平與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；阻斷劑組大鼠血清BUN水平、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠體重和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠FPG、BUN水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠血清SCr水平明顯高于模型組(P<0.05)；阻斷劑組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠體重均明顯高于補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組(P均<0.05)，而SCr水平則明顯低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和糖尿病各組大鼠干預(yù)4周后體重、FPG及腎臟指標(biāo)比較

2.3各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 光鏡下觀察顯示，空白組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，腎小囊整齊緊密排列，腎小管結(jié)構(gòu)、分布無(wú)異常；模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球肥大，基質(zhì)增生，系膜增厚，部分腎小管細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性；與模型組比較，阻斷劑組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠腎組織病理改變均不同程度改善，以補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組改善最為明顯。見圖1。

圖1 空白組和糖尿病各組大鼠干預(yù)4周后腎組織病理HE染色表現(xiàn) (×400)

2.4各組大鼠腎臟組織中Wnt蛋白表達(dá)情況 干預(yù)4周后，模型組大鼠腎臟組織中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)。與模型組比較， 阻斷劑組大鼠腎臟組織中Wnt4蛋白相對(duì)表達(dá)量和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠腎臟組織中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠腎臟組織中β-catenin、Wnt5a、Wnt4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于阻斷劑組(P均<0.05)，Wnt5a蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(P均<0.05)。見圖2及表2。

1為空白組；2為模型組；3為阻斷劑組；4為補(bǔ)陽(yáng)還五湯組；5為補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組圖2 空白組和糖尿病各組大鼠干預(yù)4周后腎臟組織中Wnt5a、Wnt4和β-catenin蛋白表達(dá)情況

表2 空白組和糖尿病各組大鼠干預(yù)4周后腎臟組織中Wnt5a、Wnt4和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

糖尿病以多飲、多食、多尿及原因不明之消瘦等為主要臨床表現(xiàn)，隨著病程延長(zhǎng)可出現(xiàn)大血管、微血管、周圍或內(nèi)臟神經(jīng)、肌肉、骨關(guān)節(jié)等各種并發(fā)癥[8]。中醫(yī)藥治療糖尿病不僅有降糖作用，還常兼有調(diào)節(jié)血脂、改善微循環(huán)、保護(hù)肝腎功能等作用[9]。劉獻(xiàn)明[10]報(bào)道，益氣養(yǎng)陰活血化瘀法可有效降低2型糖尿病患者血糖水平，改善患者癥狀。吳曉艷等[11]報(bào)道，益氣養(yǎng)陰活血化瘀法聯(lián)合纈沙坦治療早期糖尿病腎病可減輕患者的氧化應(yīng)激和微炎癥狀態(tài)，改善腎功能，延緩腎損害進(jìn)展，其效果優(yōu)于單一西藥治療。冷偉等[12]報(bào)道，在西藥治療基礎(chǔ)上聯(lián)合補(bǔ)陽(yáng)還五湯輔助治療早期糖尿病腎病，可進(jìn)一步提高近期療效，且有助于抑制腎纖維化及氧化應(yīng)激反應(yīng)。以上臨床研究表明，中藥活血化瘀方對(duì)糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥具有一定的改善作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯方中黃芪大補(bǔ)元?dú)?，氣旺以促血行，瘀去絡(luò)通；當(dāng)歸活血通絡(luò)而不傷血；赤芍、川芎、桃仁、紅花助當(dāng)歸活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)，力專善走，并引諸藥之力直達(dá)絡(luò)中。合而用之，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之效[13]。故補(bǔ)陽(yáng)還五湯多用于氣虛血瘀之中風(fēng)后遺癥，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于心血管疾病、糖尿病及其大血管、微血管并發(fā)癥等多種氣滯血瘀證治療中。本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠模型，觀察發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃可明顯降低血糖，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯單方可有效控制糖尿病大鼠的血糖。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病以肺、胃、腎為主要病變臟腑，尤以腎為關(guān)鍵。疾病早期肺燥胃熱腎虛，故“三多”之癥常相互并見，若病程日久，陰損及陽(yáng)，可致陰陽(yáng)俱虛，其中以脾腎氣陽(yáng)不足較為多見，而病久入絡(luò)，血脈瘀滯，又極易損傷腎臟[14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清SCr、BUN水平升高，腎臟指數(shù)增加，腎組織切片染色顯示腎小球和腎小管發(fā)生病變，說(shuō)明糖尿病大鼠腎臟功能受損；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腎小球和腎小管病變減輕，血清SCr、BUN水平和腎臟指數(shù)降低，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可改善糖尿病引起的腎臟損傷；補(bǔ)陽(yáng)還五湯與Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷劑同時(shí)應(yīng)用，大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)明顯改善，但血清SCr、BUN水平異常升高，這可能與該組大鼠的最終剩余數(shù)量過少導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)數(shù)量不足，或藥物間的相互影響等有一定關(guān)聯(lián)，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

近年來(lái)研究表明，Wnt信號(hào)通路異?？赡苷T發(fā)胰島素抵抗及2型糖尿病，激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與了腎損傷和腎纖維化，抑制或調(diào)整Wnt信號(hào)通路的藥物可能有助于防治糖尿病及糖尿病腎病[15]。白璐等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路的激活參與了糖尿病腎病大鼠的病情進(jìn)展，該通路中Wnt4、β-catenin在腎臟中高表達(dá)，化瘀通絡(luò)中藥可抑制Wnt4、β-catenin過表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟組織中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白均高表達(dá)；與模型組比較， 阻斷劑組大鼠腎臟組織中Wnt4蛋白相對(duì)表達(dá)量和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠腎臟組織中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯+阻斷劑組大鼠腎臟組織中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均更低。說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷劑以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯均能有效抑制糖尿病大鼠腎臟組織中Wnt蛋白的高表達(dá)，這可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯改善糖尿病大鼠腎損傷的作用機(jī)制之一。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯降低糖尿病大鼠血糖，保護(hù)腎臟功能，改善腎臟病理?yè)p傷狀態(tài)，其機(jī)制可能與抑制腎臟Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。