孟亞軍，李江濤，張 靜

(1. 中國(guó)人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院，河北 保定 071000；2. 河北省第八人民醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 保定市第二中心醫(yī)院，河北 保定 072750)

前列腺癌是前列腺上皮細(xì)胞惡性增生所致的一種腫瘤，其發(fā)病率存在明顯的地域差異,歐美地區(qū)較高[1]。我國(guó)由于人口老齡化和生活方式的西方化,近年來其發(fā)病率出現(xiàn)升高趨勢(shì),成為了威脅我國(guó)老年男性健康的重要疾病之一。前列腺癌中98%為腺癌,常從前列腺萎縮的外周部分發(fā)生,大多數(shù)為多病灶[2]。根治性前列腺切除術(shù)是治療局限于前列腺內(nèi)腫瘤的主要術(shù)式,也可作為放療后復(fù)發(fā)患者的一種補(bǔ)救治療措施[3]。內(nèi)分泌治療是前列腺治療的重要手段之一,但是絕大多數(shù)最初對(duì)內(nèi)分泌治療敏感的患者在18～24個(gè)月后轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌[4]，而目前對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌尚無有效治療策略。異黏蛋白(MTDH)是一種轉(zhuǎn)移黏附基因,是多種惡性腫瘤、炎性疾病的調(diào)節(jié)因子[5]，但其對(duì)化療藥物敏感性是否有影響尚不明確。本研究旨在通過觀察MTDH基因轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞前后細(xì)胞中MTDH的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染后對(duì)化療藥物的敏感性,探討MTDH與藥物敏感性之間的關(guān)系,從而尋找一種可以評(píng)估前列腺癌預(yù)后并指導(dǎo)治療的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物、試劑和儀器 前列腺癌PC-3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；多西他賽(DTX)購(gòu)自美國(guó)Selleck；1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青鏈霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTDH鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法

1.2.1細(xì)胞株培養(yǎng)和耐藥株構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[6]方法，將前列腺癌PC-3細(xì)胞株置于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640的培養(yǎng)基中復(fù)蘇,放于37 ℃、5%的CO2中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合80%以上時(shí),吸取培養(yǎng)瓶中的殘液,加入RPMI-1640終止。采用吸管將貼壁細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液,置于37 ℃、5%的CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。采用濃度遞增的DTX(0.1 nmol/L、0.2 nmol/L、0.5 nmol/L、1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L)間斷性刺激PC-3細(xì)胞,當(dāng)PC-3細(xì)胞株在當(dāng)前濃度下恢復(fù)到未加藥的生長(zhǎng)速度,且可以穩(wěn)定傳代,即可認(rèn)為PC-3耐DTX細(xì)胞株(PC/DTX)構(gòu)建成功。

1.2.2PC-3/DTX細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、NC-shRNA組和MTDH-shRNA組,每組取PC-3/DTX細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,對(duì)照組添加轉(zhuǎn)染試劑,NC-shRNA組轉(zhuǎn)染空載體shRNA-NC慢病毒,MTDH-shRNA組轉(zhuǎn)染MTDH-shRNA,按照Lipofectamine 3000試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1MTDH mRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR法檢測(cè)PC-3細(xì)胞和PC-3/DTX細(xì)胞中及PC-3/DTX細(xì)胞各組中MTDH mRNA表達(dá)情況：Tirzol法提取細(xì)胞中的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL,Reverse Primer C引物1 μL,Forward Primer引物1 μL；熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,40個(gè)循環(huán)；用相對(duì)定量2-ΔΔCT方法計(jì)算MTDH mRNA表達(dá)量。

1.3.2MTDH和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)：收集細(xì)胞,加入總蛋白提取液,充分吹打后放置冰上20 min,吸出勻漿液移入離心管中,9 000×g離心10 min,收集上清液,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAG電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,將膜置于脫脂奶粉中封閉,孵育60 min,棄封閉液,加入MTDH(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、mTOR(1∶200)、PI3K110α(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶200)和p-P70s6k(1∶500)一抗溶液,孵育60 min,加入二抗溶液(稀釋比例均為1∶10 000),孵育1 h,將β-actin作為內(nèi)參,化學(xué)發(fā)光和顯影、定影,Quantityone軟件分析條帶光密度值。

1.3.3細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)：將對(duì)照組、NC-shRNA組和MTDH-shRNA組PC-3/DTX細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×105/mL,每個(gè)孔以200 μL接種于96孔的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后,分別加入不同濃度的DTX(20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L),對(duì)照組不加任何藥物,設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,然后加入5 mg/mL的MTT工作液,混勻后放于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,離心后,去上清,每個(gè)孔中加入200 μL的二甲基亞砜,采用Bio-rad酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.3.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,采用0.25%的胰酶和2%的EDTA消化,用50 μL的PBS重懸細(xì)胞,離心10 min,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到試管中,分別加入5 μL的Annexin Ⅴ和10 μL的PI孵育15 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè),采用Cellquest 1.2軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1PC-3和PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH mRNA及蛋白表達(dá)情況 PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.36±0.29和1.42±0.32，PC-3細(xì)胞中分別為0.48±0.11和0.56±0.13，PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較PC-3細(xì)胞中高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2各組PC-3/DTX細(xì)胞中MTDH mRNA及蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組和NC-shRNA組MTDH mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組MTDH mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見圖1和表1。

圖1 各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞中MTDH蛋白表達(dá)情況

表1 各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞中MTDH mRNA及蛋白表達(dá)情況

2.3各組PC-3/DTX細(xì)胞存活情況 不同濃度的DTX作用24 h后,對(duì)照組和NC-shRNA組細(xì)胞存活率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組細(xì)胞存活率均明顯低于對(duì)照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度的多西他賽作用24 h后各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞存活率比較

2.4各組PC-3/DTX細(xì)胞凋亡情況 對(duì)照組、NC-shRNA組、MTDH-shRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(5.87±1.69)%、(6.03±1.74)%、(33.52±8.46)%，對(duì)照組和NC-shRNA組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MTDH-shRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞凋亡情況

2.5各組PC-3/DTX細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組和NC-shRNA組PC-3/DTX細(xì)胞中PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組PC-3/DTX細(xì)胞中PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組和NC-shRNA組(P均<0.05)，3組Akt和mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3和圖3。

圖3 各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況

表3 各組PC-3耐多西他賽細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率與年齡有關(guān)，70～80歲人群高發(fā)[7]。目前前列腺癌缺乏有效治療手段,DEX是化療主要用藥，初次用藥有效，但患者多在6.3個(gè)月左右出現(xiàn)腫瘤耐藥,導(dǎo)致治療失敗[8]。腫瘤耐藥是指長(zhǎng)期使用某種藥物過程中,腫瘤細(xì)胞對(duì)于藥物作用產(chǎn)生耐受性,導(dǎo)致藥物作用顯著降低甚至無效[9-10]。在沒有新的替代藥物出現(xiàn)的情況下，如何逆轉(zhuǎn)DEX的耐藥,增強(qiáng)DEX化療方案的敏感性成為研究重點(diǎn)。近年來,采用RNA干擾技術(shù),通過基因沉默的方式逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥研究取得了一定的成果,故本研究進(jìn)行了相關(guān)探討。

MTDH基因又稱為AEG-1基因,由582個(gè)氨基酸組成,分子量64 kDa，起初在艾滋病病毒(HIV)包膜蛋白、腫瘤壞死因子或HIV-1感染處理過的原代培養(yǎng)的人胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中均有表達(dá)[11-12]。MTDH是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、血管生成和抑制其凋亡等作用[13]。MTDH在前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控和向惡性表型轉(zhuǎn)化方面起重要作用，阻斷MTDH的信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)恢復(fù)細(xì)胞的表型，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,并抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。張玲芳等[15]研究表明,MTDH過表達(dá)引起的P-gp過表達(dá)和Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化,可能與乳腺癌化療耐藥有關(guān)。侯贊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p可通過靶向抑制MTDH的表達(dá)增強(qiáng)人前列腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)C-3/PTX的化學(xué)敏感性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH mRNA及蛋白表達(dá)量明顯增高；沉默MTDH后，PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH mRNA及蛋白表達(dá)量和PC-3/DTX細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯增高,PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白表達(dá)量明顯降低。提示PC-3/DTX細(xì)胞株中MTDH高表達(dá),MTDH可能通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡,沉默PC-3/DTX細(xì)胞株MTDH基因后,可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,從而抑制PC-3/DTX細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并提高耐藥細(xì)胞對(duì)DTX的敏感性，將MTDH作為分子靶向的靶點(diǎn)在前列腺癌的治療領(lǐng)域有著廣闊的前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。