王 陽(yáng)，邊玉培，卜曉玲

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

盆腔炎性疾病指女性上生殖道感染性疾病，若未能及時(shí)、徹底治療可能會(huì)發(fā)生盆腔炎性疾病后遺癥,主要病理改變?yōu)閺V泛組織破壞、粘連、增生及瘢痕形成，導(dǎo)致不孕、異位妊娠、反復(fù)發(fā)作的慢性盆腔痛等[1]，嚴(yán)重危害女性身心健康。盆腔炎性疾病后遺癥引起的慢性盆腔痛常由粘連、瘢痕形成以及盆腔充血導(dǎo)致，目前尚無(wú)有效的治療方法[2]，西醫(yī)主要給予非甾體抗炎藥對(duì)癥處理，但長(zhǎng)期反復(fù)使用對(duì)機(jī)體有明顯的不良影響,并易產(chǎn)生耐藥性[3]。中醫(yī)藥治療盆腔炎性疾病后遺癥具有一定優(yōu)勢(shì)，屬于中醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種[4-5]。參芪扶正湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院治療盆腔炎性疾病后遺癥的經(jīng)驗(yàn)方，口服及保留灌腸均有一定療效，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以盆腔炎性疾病后遺癥的主要病理改變即盆腔粘連為切入點(diǎn)，通過觀察小鼠上生殖道中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1( TGF-β1)、I型膠原蛋白(collagen I)表達(dá)情況，探討了參芪扶正湯治療盆腔炎性疾病后遺癥的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康7～8周齡雌性BALB/c小鼠60只，體重(20±1)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。SPF級(jí)動(dòng)物環(huán)境，自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(BUCM-4-20180312011-1017)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 參芪扶正湯(丹參10 g、黃芪15 g、黨參15 g、當(dāng)歸10 g、白術(shù)15 g、赤芍10 g、雞血藤10 g、桑枝10 g、延胡索9 g)顆粒劑，加10倍蒸餾水充分稀釋，常壓濃縮調(diào)整至濃度為0.85 g生藥/mL的溶液，中藥購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房，由北京康仁堂有限公司提供。阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171021，規(guī)格：100 mg/片)，溶于0.5%羧甲基纖維素鈉中，配置成濃度為10 mg/mL的阿司匹林溶液。所有溶液均密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 濃鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)：20180306)，脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：12190801), 孕馬血清促性腺激素(PMSG,寧波第二激素廠，批號(hào)：190723), GAPDH一抗(美國(guó)bioworld公司，AP0063)，TNF-α一抗(美國(guó)Abcam公司，ab183218)、TGF-β1一抗(美國(guó)Abcam公司，ab215715)、collagen I一抗(美國(guó)CST公司，#72026)，二抗(美國(guó)KPL公司，074-1506)。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，紫外分光光度計(jì)(德國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)，電泳槽、轉(zhuǎn)移槽、電泳儀(中國(guó)北京六一儀器廠)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，除空白組外，其余組小鼠參考文獻(xiàn)[6]方法造模。具體方法：造模日前2 d，每只小鼠皮下注射PMSG 7.5 IU，1次/d，共2 d；空白組皮下注射0.9%氯化鈉溶液。造模日，除空白組小鼠宮頸內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液外，其余組小鼠均宮頸內(nèi)注射鹽酸25 mg/kg。注射完畢2 h后，空白組小鼠宮頸內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液，其余組小鼠均宮頸內(nèi)注射LPS 50 mg/kg，每2 h 1次，共4次。最后一次宮頸注射LPS 10 h后對(duì)小鼠進(jìn)行臉譜疼痛(MGS)評(píng)估[7]：?jiǎn)问止潭ㄐ∈笫蛊鋺铱昭錾欤蓚?cè)髂前上棘的連線做3等分，在2個(gè)等分點(diǎn)上用棉簽深壓腹部，若小鼠面部表情出現(xiàn)變化或掙扎，同時(shí)伴有安靜狀態(tài)下弓背、炸毛、閉眼、反應(yīng)能力下降中任意一項(xiàng)，同時(shí)眼眶取血檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)目升高，則判定造模成功。造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)6周，形成盆腔炎性疾病后遺癥小鼠模型后，阿司匹林組予阿司匹林腸溶片溶液灌胃，參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組分別予參芪扶正湯灌胃、灌腸，參芪扶正湯灌胃灌腸組給予參芪扶正湯灌胃及參芪扶正湯灌腸，空白組及模型組予等體積等濃度羧甲基纖維素鈉灌胃。小鼠藥物用量根據(jù)成人服用劑量，按照千克體重劑量換算公式Db=Da·(Kb/Ka)·(Wa/Wb)1/3進(jìn)行計(jì)算[8]，小鼠等劑量的給藥量約為成人用藥量的6倍，故阿司匹林腸溶片用藥量為0.2 mg/(g·d)、參芪扶正湯用藥量為17 mg/(g·d),每周稱重1次，調(diào)整給藥量。各組均連續(xù)干預(yù)3個(gè)動(dòng)情周期(每個(gè)動(dòng)情周期4～5 d)。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1MGS評(píng)分 各組小鼠均于最后一次干預(yù)后第2天，由實(shí)驗(yàn)人員實(shí)施盲法評(píng)估，觀察小鼠面部表情(眼眶收緊、聳鼻尖、鼓起兩腮、耳朵位置、胡須擺動(dòng))，面部表情無(wú)變化為0分，有輕微面部表情變化為1分，有明顯面部表情變化為2分，取兩側(cè)評(píng)分相加后的總分[9]。

1.6.2上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I表達(dá)情況 最后一次干預(yù)后，小鼠饑餓12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.33 mL/100 g)麻醉小鼠，常規(guī)消毒腹部皮膚，打開腹腔，快速進(jìn)行上生殖道(子宮、輸卵管、卵巢)取材。將同一只小鼠的子宮、輸卵管、卵巢置于同一凍存管內(nèi)，迅速移入-80 ℃液氮凍存。每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本，Western blot法重復(fù)檢測(cè)3次：將小鼠上生殖道組織加液氮進(jìn)行勻漿，加入1 mL PBS，500×g離心5 min，吸干PBS，加入5倍體積裂解液，混勻，冰浴中以最大超聲波擊碎細(xì)胞。4 ℃下12 000 r/min離心(離心半徑9.0 cm)15 min收集取上清。BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。以GAPDH作為上樣量?jī)?nèi)參，將30 μg樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分離后的蛋白60 V恒壓60 min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。封閉液室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗4 ℃過夜，再置于二抗稀釋液中室溫孵育2 h，采用DAB顯色和ECL曝光，并用Lab Works軟件進(jìn)行灰度分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量以TNF-α、TGF-β1、collagen I與GAPDH光密度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠MGS評(píng)分比較 空白組、模型組、阿司匹林組、參芪扶正湯灌胃組、參芪扶正湯灌腸組、參芪扶正湯灌胃灌腸組小鼠MGS評(píng)分分別為(1.30±0.95)分、(3.70±2.0)分、(3.50±1.18)分、(3.10±1.00)分、(2.50±0.85)分、(2.40±0.97)分，模型組小鼠MGS評(píng)分明顯高于空白組(P<0.05)，各藥物組小鼠MGS評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)，參芪扶正湯各組MGS評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2各組小鼠上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量比較 模型組小鼠上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)。參芪扶正湯各組小鼠上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，但參芪扶正湯各組間TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；阿司匹林組小鼠上生殖道組織中僅TNF-α相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)，TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1及表1。

A為空白組；B 為模型組；C 為阿司匹林組；D為參芪扶正湯灌胃組； E為參芪扶正湯灌腸組； F為參芪扶正湯灌胃灌腸組圖1 空白組和盆腔炎性疾病各組小鼠上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I表達(dá)情況

表1 空白組和盆腔炎性疾病后遺癥各組小鼠上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

盆腔炎性疾病后遺癥屬中醫(yī)“婦人腹痛”“帶下病”“月經(jīng)病”“不孕癥”等范疇，多由濕熱邪毒未盡，客于沖任胞宮所致。因余邪留戀，阻滯沖任胞宮胞脈，氣血運(yùn)行受阻，日久成瘀。病情反復(fù)，正邪交爭(zhēng)，耗損正氣，日久必虛。因此，盆腔炎性疾病后遺癥以“虛”“瘀”為基本特征，可兼有肝郁、濕熱、寒濕，是虛實(shí)夾雜、寒熱錯(cuò)綜之證，治宜扶正化瘀。在金哲教授經(jīng)驗(yàn)方丹枝飲基礎(chǔ)上，課題組結(jié)合盆腔炎性疾病后遺癥特點(diǎn)加減化裁而形成參芪扶正湯。方中丹參為君藥，入血分，具有活血化瘀止痛之功及祛瘀生新之效，《婦人名理論》有“一味丹參散,功同四物湯”之說(shuō)，表明丹參可針對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥“瘀”“虛”的根本病機(jī)。黃芪、黨參、白術(shù)益氣健脾，扶助正氣，當(dāng)歸補(bǔ)血、活血，四藥共為臣藥。赤芍清熱涼血、祛瘀止痛，雞血藤、桑枝祛瘀通絡(luò)，延胡索活血行氣止痛，為佐藥。全方共奏益氣養(yǎng)血、化瘀止痛之功。眾多研究顯示，丹參的主要活性成分丹參酮ⅡA除具有抗菌消炎作用外，還能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路，緩解纖維化[10-12]。另外黃芪、丹參配伍后丹參酮ⅡA和丹酚酸B的提取率更高[13]，二者配伍可以增強(qiáng)祛瘀止痛之功[14]。白術(shù)能通過抑制TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[15]。

盆腔炎性疾病后遺癥的主要病理生理學(xué)改變是組織粘連、增生及瘢痕形成。研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕瘤患者血清中TNF-α、TGF-β1水平升高[16]。TNF-α由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是常見的促炎因子，且能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,從而利于膠原纖維的形成[17]。TGF-β1是介導(dǎo)膠原合成的最重要的促纖維化標(biāo)志物，參與組織創(chuàng)傷修復(fù)[18]。TGF-β1可通過信號(hào)蛋白Smad2/3的活化，促進(jìn)膠原和纖維連接蛋白等細(xì)胞外機(jī)制成分的表達(dá)，并通過抑制蛋白酶活性和增加蛋白酶抑制劑來(lái)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而誘導(dǎo)多種組織器官中成纖維細(xì)胞的增殖、分化[19]。當(dāng)成纖維細(xì)胞增殖, 持續(xù)過度分泌膠原蛋白則會(huì)產(chǎn)生大量的collagen I，并異常沉積，最終形成粘連、瘢痕。所以TGF-β1是collagen I合成的主要調(diào)控因子[20]。綜上，抑制TNF-α、TGF-β1表達(dá)，有可能抑制collagen I形成，進(jìn)而抑制瘢痕形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠MGS評(píng)分及上生殖道組織中TNF-α、TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量明顯升高，證實(shí)盆腔炎性疾病后遺癥小鼠上生殖道存在炎癥因子浸潤(rùn)、粘連及瘢痕形成的病理狀態(tài)。各藥物組小鼠MGS評(píng)分均明顯低于模型組，表明阿司匹林及參芪扶正湯灌胃、灌腸、灌胃聯(lián)合灌腸均能緩解盆腔炎性疾病后遺癥小鼠盆腔疼痛。各藥物組小鼠上生殖道組織中TNF-α相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組，提示阿司匹林及參芪扶正湯灌胃、灌腸、灌胃聯(lián)合灌腸均可降低炎癥因子TNF-α表達(dá)。參芪扶正湯各組小鼠上生殖道組織中TGF-β1、collagen I相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組，提示參芪扶正湯灌胃、灌腸及灌胃聯(lián)合灌腸均能下調(diào)小鼠上生殖道組織中TGF-β1、collagen I表達(dá)。但參芪扶正湯各組間小鼠MGS評(píng)分及TNF-α、TGF-β1、collagen I表達(dá)均未顯示出明顯差異，提示參芪扶正湯灌胃聯(lián)合灌腸較單一灌胃或灌腸而言，在降低盆腔痛、炎癥因子及粘連相關(guān)因子表達(dá)方面并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，參芪扶正湯可緩解盆腔炎性疾病后遺癥所致的慢性盆腔痛，抑制上生殖道炎癥因子及粘連、纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，這可能是其治療盆腔炎性疾病后遺癥的機(jī)制之一；參芪扶正湯單一給藥方式即可對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥起到一定的治療效果，無(wú)需口服聯(lián)合灌腸的多途徑給藥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。