裴 迅，左新河，趙 勇，李 揚(yáng)，付 暢

（湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430074）

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以甲狀腺腫大伴結(jié)節(jié)為主要表現(xiàn)，多在彌漫性腫大的基礎(chǔ)上發(fā)生，為彌漫性腫大的晚期表現(xiàn)[1]。近年來(lái)其發(fā)病有明顯上升趨勢(shì)，雖然多為良性結(jié)節(jié)，但由于患者一方面擔(dān)心結(jié)節(jié)繼續(xù)增大而引起壓迫癥狀需要接受手術(shù)治療，另一方面擔(dān)心其惡變，給患者的生活帶來(lái)了困擾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此，控制結(jié)節(jié)的增大及阻止其向惡性轉(zhuǎn)化成為當(dāng)前內(nèi)科治療的關(guān)鍵。中醫(yī)學(xué)將結(jié)節(jié)性甲狀腺腫歸于“癭病”范疇，認(rèn)為痰瘀、氣滯是其主要病理因素[3]。湖北省陳氏中醫(yī)癭病學(xué)術(shù)流派代表性傳承人陳如泉教授所擬中藥復(fù)方制劑活血消癭方，是活血化痰、消癭散結(jié)治法的代表方，用以治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，臨床療效確切[4-5]，然而其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也被稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎性損傷的炎性啟動(dòng)子[6-7]。因此，本研究將構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的TFECs損傷模型，觀察活血消癭方含藥血清對(duì)TFECs損傷模型細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況的影響，并探討其作用機(jī)制是否與Janus激酶2（Janus kinase2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路有關(guān)，旨在為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的中醫(yī)治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量140～160 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠均在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室集中分籠飼養(yǎng)，5只/籠，飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（20℃）、恒濕（50%）、12/12 h循環(huán)，自由飲食飲水，生長(zhǎng)良好。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循3R原則處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 藥物與試劑 活血消癭方由蜣螂蟲、土鱉蟲、蜈蚣、桃仁、莪術(shù)、貓爪草、王不留行、柴胡等組成，上述藥材均由本院藥劑科提供；LPS（批號(hào)：L5293）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；優(yōu)甲樂(lè)（左甲狀腺素鈉片）（批號(hào)：H20140052）購(gòu)自德國(guó)默克公司；MTT試劑（批號(hào)：ST1537）購(gòu)自上海碧云天公司；甲狀腺球蛋白（Tg）抗體（批號(hào)：ab156008）、JAK2抗體（批號(hào)：ab32101）、p-JAK2抗體（批號(hào)：ab32101）、STAT3抗體（批號(hào)：ab68153）、p-STAT3抗體（批號(hào)：ab267373）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抗體（Caspase-8）（批號(hào)：ab32397）、Caspase-3抗體（批號(hào)：ab32351）、B淋巴細(xì)胞瘤-2抗體（Bcl-2）（批號(hào)：ab32124）、Bax抗體（批號(hào)：ab32503）、p53抗體（批號(hào)：ab26）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：GK10009）購(gòu)自美國(guó)Glpbio公司；胰蛋白酶（批號(hào)：E020）購(gòu)自上海如吉生物公司。1.3主要儀器SMZ745型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；DYCZ-24EN型蛋白電泳儀、170-3940型Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；GIS-500型凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 TFECs原代細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將文獻(xiàn)[8]的方法改良后，無(wú)菌分離SD雄性大鼠雙側(cè)甲狀腺組織。將每側(cè)甲狀腺組織剪切成1.5 cm3的小塊，消化酶（含0.5 mL的206 kU/L膠原酶I和0.5 mL的2.75 kU/L消化酶）消化、離心后，棄上清，使用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，經(jīng)特異抗原NIS免疫熒光染色鑒定為TFECs后，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每隔3 d換液1次。

2.2 制備活血消癭方含藥血清 取30只SD雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、優(yōu)甲樂(lè)組和活血消癭方組，每組10只。優(yōu)甲樂(lè)組和活血消癭方組大鼠每天分別灌服0.1 mg/L的優(yōu)甲樂(lè)溶液2 mL和27 g/kg的活血消癭方，對(duì)照組大鼠每天灌服等體積的雙蒸水，連續(xù)7 d。大鼠于末次灌胃1 h后，摘除眼球取血，無(wú)菌分離得到對(duì)照血清、優(yōu)甲樂(lè)含藥血清和活血消癭方含藥血清，經(jīng)56℃、30 min滅活處理，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT法檢測(cè)TFECs增殖情況TFECs接種至96孔板，24 h后，除去原來(lái)的培養(yǎng)液，分別添加0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%、80.0%活血消癭方含藥血清和對(duì)照血清，孵育12 h后，采用1 mg/L LPS[9]處理24 h，然后分別加入20 μL MTT試劑（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值，并計(jì)算其增殖抑制率（%）=（A對(duì)照組-A給藥組）/A對(duì)照組×100%。然后使用SPSS 22.0軟件通過(guò)增殖抑制率計(jì)算活血消癭方半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 細(xì)胞模型的建立與分組 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將體外培養(yǎng)的TFECs分為對(duì)照組、模型組、低濃度活血消癭方含藥血清組、中濃度活血消癭方含藥血清組、高濃度活血消癭方含藥血清組和優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組。對(duì)照組培養(yǎng)基中加入對(duì)照血清；模型組培養(yǎng)基中加入對(duì)照血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；低濃度活血消癭方含藥血清組培養(yǎng)基中加入50%IC50即10%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；中濃度活血消癭方含藥血清組培養(yǎng)基中加入100%IC50即20%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；高濃度活血消癭方含藥血清組培養(yǎng)基中加入含200%IC50即40%活血消癭方含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h；優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組培養(yǎng)基中加入優(yōu)甲樂(lè)含藥血清處理12 h后，再用1 mg/L LPS處理24 h。給藥結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 ELISA法檢測(cè)各組TFECs中炎癥因子水平 使用ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6水平，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組TFECs凋亡率 收集各組TFECs，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定其凋亡情況，計(jì)算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.7 Western blotting檢測(cè)各組TFECs中各蛋白表達(dá)水平 提取各組TFECs總蛋白后進(jìn)行定量、電泳及轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉 后 加 入Tg、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53抗體，4℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。ECL顯影后，以GAPDH為內(nèi)參，分析各組TFECs中各蛋白表達(dá)情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs增殖的影響與對(duì)照血清組比較，不同濃度活血消癭方含藥血清處理后細(xì)胞增殖抑制率均明顯升高（P<0.05），且增殖抑制率隨著濃度的增加而升高。活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs增殖抑制率的IC50為20%。（見表1）

表1 活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs增殖的影響（±s，n=6）

表1 活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs增殖的影響（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

組別 增殖抑制率（%）對(duì)照血清組 -0.5%活血消癭方含藥血清組 4.62±0.83a 1%活血消癭方含藥血清組 8.43±1.08a 2.5%活血消癭方含藥血清組 16.75±1.65a 5%活血消癭方含藥血清組 30.54±2.68a 10%活血消癭方含藥血清組 41.32±3.05a 20%活血消癭方含藥血清組 50.96±2.13a 40%活血消癭方含藥血清組 83.16±1.62a 80%活血消癭方含藥血清組 90.48±1.71a F 1925.000 P 0.000

3.2 活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs形態(tài)的影響對(duì)照組TFECs呈多邊形或瓷磚樣，細(xì)胞較小且排列緊密，膠質(zhì)豐富，折射清晰；與對(duì)照組比較，模型組TFECs變大，排列松散，呈碎片狀，膠質(zhì)減少，折射不清晰；與模型組比較，優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組和低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs排列逐漸緊密，且膠質(zhì)增多。（見圖1）

圖1 各組TFECs形態(tài)比較（×200）

3.3 活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs細(xì)胞中Tg蛋白的影響 與對(duì)照組比較，模型組TFECs細(xì)胞中Tg蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs細(xì)胞中Tg蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），且具有濃度依賴性；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs細(xì)胞中Tg蛋白表達(dá)與優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組TFECs中Tg蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

表2 各組TFECs中Tg蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

組別 Tg對(duì)照組 0.73±0.02模型組 0.35±0.03a低濃度活血消癭方含藥血清組 0.49±0.02b中濃度活血消癭方含藥血清組 0.57±0.03b c高濃度活血消癭方含藥血清組 0.71±0.05b c d優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組 0.72±0.04b c d F 127.612 P 0.000

3.4 活血消癭方對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs中炎癥因子的影響 與對(duì)照組比較，模型組TFECs中TNF-α、IL-6含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中TNF-α、IL-6含量均明顯降低（P＜0.05），且低濃度活血消癭方含藥血清組＞中濃度活血消癭方含藥血清組＞高濃度活血消癭方含藥血清組；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中TNF-α、IL-6含量與優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組TFECs中炎癥因子水平比較（±s，n=6）

表3 各組TFECs中炎癥因子水平比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

組別 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）對(duì)照組 31.25±8.36 19.16±6.47模型組 76.41±10.32a 52.57±7.23a低濃度活血消癭方含藥血清組 60.34±9.24b 40.75±6.53b中濃度活血消癭方含藥血清組 46.17±9.78b c 29.29±6.89b c高濃度活血消癭方含藥血清組 30.36±10.21b cd 18.34±7.32b cd優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組 29.46±8.15b cd 17.24±7.18b cd F 25.435 25.890 P 0.000 0.000

3.5 活血消癭方對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs凋亡的影響 與對(duì)照組比較，模型組TFECs凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和Bax表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），而Bcl-2和p53蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），而Bcl-2和p53蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)水平與優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2～3、表4～5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP＜0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP＜0.05

圖2 各組TFECs凋亡流式圖

3.6 活血消癭方對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs中JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白的影響 與對(duì)照組比較，模型組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯下調(diào)（P＜0.05）；高濃度活血消癭方含藥血清組TFECs中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值與優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4、表6）

表6 各組TFECs中JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白比較（±s，n=6）

表6 各組TFECs中JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與低濃度活血消癭方含藥血清組比較，cP<0.05；與中濃度活血消癭方含藥血清組比較，dP<0.05

組別 p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3對(duì)照組 0.23±0.03 0.26±0.02模型組 0.65±0.05a 0.71±0.04a低濃度活血消癭方含藥血清組 0.52±0.04b 0.58±0.04b中濃度活血消癭方含藥血清組 0.37±0.03b c 0.41±0.05b c高濃度活血消癭方含藥血清組 0.22±0.04b cd 0.25±0.03b cd優(yōu)甲樂(lè)含藥血清組 0.21±0.02b cd 0.24±0.03b cd F 153.600 178.527 P 0.000 0.000

圖4 各組TFECs中JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)免疫印跡圖

圖3 各組TFECs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖

4 討論

由于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病情的反復(fù)進(jìn)展，濾泡上皮由彌漫性增生轉(zhuǎn)變?yōu)榫衷钚栽錾?，同時(shí)發(fā)生增生性病變和退行性病變的反復(fù)交替。腺體內(nèi)出現(xiàn)不同發(fā)展階段的結(jié)節(jié)，出現(xiàn)毒性癥狀時(shí)，即為毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；若上皮細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度增生，可進(jìn)一步形成腺瘤或乳頭狀腺癌，也可形成甲狀腺癌，且具有較高的癌變率[11]。國(guó)內(nèi)報(bào)道結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲狀腺癌發(fā)生率逐年升高[12]。因此，明確結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的轉(zhuǎn)化機(jī)制不僅能為早期診斷提供支持，還能進(jìn)一步研究出阻止結(jié)節(jié)性甲狀腺腫發(fā)展的針對(duì)性干預(yù)措施，進(jìn)而降低其癌變率或延緩其發(fā)展進(jìn)程。

中醫(yī)學(xué)將結(jié)節(jié)性甲狀腺腫歸屬于“癭病”范疇，認(rèn)為痰瘀貫穿于整個(gè)病程之中[12]。陳如泉根據(jù)痰血瘀阻理論創(chuàng)立了活血消癭方，該方在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的臨床治療中被廣泛使用[13]。吳淑瓊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，活血消癭方能夠通過(guò)降低結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子水平并適度升高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1水平來(lái)發(fā)揮治療作用。此外，活血消癭片合夏枯草膠囊可有效治療橋本甲狀腺炎伴結(jié)節(jié)[14]。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)活血消癭片能夠有效降低缺碘性甲狀腺腫模型大鼠的甲狀腺質(zhì)量，但對(duì)甲狀腺功能的影響較小。目前，活血消癭方治療甲狀腺疾病的分子機(jī)制尚不明確。本研究表明，LPS誘導(dǎo)后TFECs細(xì)胞損傷加重，Tg表達(dá)降低，TNF-α、IL-6升高，且表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡，以上結(jié)果均說(shuō)明模型構(gòu)建成功。Tg蛋白是TFECs細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)的主要成分，其含量可反映TFECs的損傷程度[16]。有研究[17]表明，優(yōu)甲樂(lè)對(duì)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫有治療作用。因此，本研究以優(yōu)甲樂(lè)含藥血清為陽(yáng)性對(duì)照，觀察活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠TFECs損傷模型細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，活血消癭方含藥血清可改善TFECs損傷，增加膠質(zhì)含量，且能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子和凋亡率的升高。說(shuō)明活血消癭方含藥血清能通過(guò)降低凋亡蛋白和炎癥因子表達(dá)來(lái)改善LPS誘導(dǎo)的大鼠TFECs凋亡，并減輕其炎性損傷。

JAK2/STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞損傷或細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。JAK2是STAT3的上游激活劑，LPS的刺激可使JAK2活化，從而促進(jìn)下游STAT3蛋白發(fā)生磷酸化，最后導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18-19]。另外，JAK2、STAT3磷酸化程度的降低能夠抑制LPS誘發(fā)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥的發(fā)生[20]。然而，目前尚無(wú)JAK2/STAT3信號(hào)通路在TFECs中的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的TFECs中JAK2、STAT3磷酸化水平顯著上調(diào)，與QIN Y等[21]在肺泡上皮細(xì)胞中的研究一致，而活血消癭方含藥血清能抑制其磷酸化。說(shuō)明活血消癭方含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的TFECs凋亡和損傷的抑制作用可能是通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，活血消癭方含藥血清可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，減輕LPS誘導(dǎo)的TFECs炎性損傷，并抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果可為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的中醫(yī)治療提供新思路，但是本研究?jī)H在細(xì)胞層面探討了活血消癭方的作用機(jī)制，后續(xù)仍需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)深入研究。