陸 寧， 蒲順昌， 邢 爽， 孫玉喜， 丁德杰， 屈業(yè)鋒， 張志祥， 張慧敏*

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800； 2.藥食同源功能食品亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800)

環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)又稱環(huán)丙氟哌酸,是第三代氟喹諾酮類藥物[1-2]。環(huán)丙沙星具有廣譜抗菌活性,殺菌效果好,曾普遍應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的疾病治療[3-4]。然而人類長(zhǎng)期食用有環(huán)丙沙星殘留的水產(chǎn)品會(huì)對(duì)健康造成損害,引發(fā)食源性疾病,出現(xiàn)胸悶、呼吸困難等心血管系統(tǒng)反應(yīng)癥狀,有的會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶尿甚至血尿,對(duì)腎臟有一定的損害,還會(huì)誘發(fā)精神失常、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng),其中變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率最高,主要表現(xiàn)為過(guò)敏性哮喘、休克等[5-6]。

目前,環(huán)丙沙星已被歐盟、中國(guó)等列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物[7-8]。水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的檢測(cè)越來(lái)越引起人們的重視。

環(huán)丙沙星的檢測(cè)方法目前主要有微生物法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等,這些方法不僅操作繁瑣、儀器價(jià)格昂貴,而且不適合大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[9-12]。以免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法,具有快速、靈敏、價(jià)格低廉、適合大規(guī)模檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),是目前公認(rèn)最適合作為藥物殘留檢測(cè)的快速篩選方法之一[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)將CIP與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原,免疫新西蘭大白兔,制備高特異性的CIP抗體,對(duì)抗原抗體結(jié)合性能進(jìn)行優(yōu)化,開(kāi)發(fā)出一種高靈敏度的環(huán)丙沙星特異性快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N,N-二甲基酰胺(DMF)，牛血清蛋白(BSA)，雞卵血清蛋白(OVA)，弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司),正辛酸，硫酸銨，氫氧化鈉(廣州臺(tái)山粵橋化工廠);脫脂奶粉(食用級(jí)安怡公司);酶標(biāo)二抗(美國(guó)Bioworld公司)；TMB顯色液，吐溫-20(北京索萊寶科技有限公司)；魚肉、雞蛋(當(dāng)?shù)爻?。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204電子天平(美國(guó)Mettler toledo公司);ND1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);QL-861振蕩器(海門市其林貝爾儀器有限公司);6K15冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sartorius-Sigma公司);M2E多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular device公司);DHG-9145電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海恒一科技有限公司);DK-8D電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人工抗原的制備與鑒定 利用活潑酯法,將2 mg環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品與2 mg NHS和2 mg EDC共同溶解于500 μL DMF中,4 ℃下避光攪拌過(guò)夜。取5 mg的BSA溶解于1 mL 0.1 mol/L pH 9.6碳酸鹽溶液中,將250 μL環(huán)丙沙星半抗原活化液緩慢向BSA的反應(yīng)溶液中滴加,室溫下攪拌3 h。用同樣的方法制備CIP-OVA、OFL-OVA。將所得到的反應(yīng)溶液在4 ℃下,用磷酸鹽緩沖溶液透析3 d(每12 h換1次透析液),得到目標(biāo)產(chǎn)物CIP-BSA、CIP-OVA、OFL-OVA,于-20 ℃分裝保存[15]。偶聯(lián)產(chǎn)物通過(guò)紫外吸收光譜來(lái)鑒定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)成功。

1.3.2 動(dòng)物免疫 選用健康雌性新西蘭大白兔進(jìn)行免疫。取250 μL 1 mg/mL的免疫原CIP-BSA與等量弗氏完全佐劑混合進(jìn)行乳化。采用皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫,每只免疫350 μL劑量。免疫周期間隔3周,自第2次免疫開(kāi)始,均取免疫原與等量的弗氏不完全佐劑混合乳化。共進(jìn)行4次免疫后,間隔1周采血清,混入等量甘油,于-20 ℃保存。

1.3.3 多克隆抗體的純化 取兔血清在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,將上清液與醋酸鹽緩沖液按1∶2比例混合,pH調(diào)至4.8。向混合液中逐滴加入少量正辛酸,室溫下攪拌30 min,于4 ℃下靜置2 h。4 ℃下12 000 r/min離心15 min,用125 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾上清溶液。向反應(yīng)溶液中加入磷酸鹽緩沖液,pH調(diào)至7.4。冰浴條件下,于30 min內(nèi)向反應(yīng)溶液中加入0.28 g/mL的硫酸銨,靜置1 h以上。4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,棄上清液,沉淀用磷酸鹽緩沖液透析3 d,得到的純化抗體在-20 ℃條件下保存。

1.3.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)多克隆抗體性能 將異源包被原氧氟沙星-OVA與同源包被原環(huán)丙沙星-OVA分別用包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋至1 μg/mL后,向96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL,37 ℃水浴過(guò)夜,用5%脫脂奶粉封閉后制板成功。利用制備好的酶標(biāo)板,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法比較同源、異源包被條件下的檢測(cè)結(jié)果,篩選出效價(jià)更好、識(shí)別環(huán)丙沙星靈敏度更高的包被原及多克隆抗體。

1.3.5 包被原濃度及抗體稀釋倍數(shù)的確定 將包被原(環(huán)丙沙星-OVA)用包被液按1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000倍稀釋,抗體用磷酸鹽緩沖液按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000進(jìn)行稀釋。用10 ng/mL的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品做抑制對(duì)比,進(jìn)行ELISA反應(yīng),計(jì)算每個(gè)包被原濃度與抗體稀釋倍數(shù)組合的抑制率,確定最適宜的包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選擇包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)最適宜的3個(gè)組合,用磷酸鹽緩沖液將環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0、0.001 9、0.015、0.122、0.977、7.81、62.6、500 ng/mL,每孔分別加入50 μL抗體和50 μL環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行EILSA實(shí)驗(yàn)。利用Origin 8.5擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.3.7 交叉實(shí)驗(yàn) 將環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)類似物:馬波沙星、莫西沙星、吡哌酸、萘啶酸、如氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、普盧利沙星與環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下分別進(jìn)行ELISA測(cè)定,計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線的半抑制濃度,以環(huán)丙沙星為基準(zhǔn)(100%),考察交叉反應(yīng)的情況。

CR=IC50(環(huán)丙沙星)/IC50(其余結(jié)構(gòu))×100%

1.3.8 回收試驗(yàn) 將1 g魚肉組織切碎,放入離心管,加入2 mL三氯乙酸(7.5% TCA)混勻,4 ℃下5 000 r/min離心10 min,用磷酸鹽緩沖液稀釋50倍得到魚肉樣品。稱取1 g雞蛋樣品置于離心管中,加5 mL三氯乙酸(7.5% TCA)混勻,4 ℃下5 000 r/min離心10 min,用磷酸鹽緩沖液稀釋20倍得到雞蛋樣品。向魚肉樣品中添加1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品,向雞蛋樣品中添加2、1、0.5 ng/mL的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品,按照ELISA步驟測(cè)定,每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù),計(jì)算添加回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的制備與鑒定

CIP、BSA、CIP-BSA的紫外掃描結(jié)果如圖1所示,CIP在208和256 nm有吸收特征峰,BSA在280 nm有吸收特征峰,CIP與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)后,CIP-BSA特征峰向左發(fā)生偏移,相對(duì)于CIP和載體蛋白有明顯改變,表明載體蛋白與CIP偶聯(lián)成功。CIP、OVA、CIP-OVA的紫外掃描結(jié)果如圖2所示,CIP與載體蛋白OVA偶聯(lián)反應(yīng)后,CIP-OVA特征峰發(fā)生偏移,表明載體蛋白OVA與CIP偶聯(lián)成功。OFL、OVA、OFL-OVA的紫外掃描結(jié)果如圖3所示,OFL與OVA偶聯(lián)反應(yīng)后,OFL-OVA特征峰發(fā)生偏移,相對(duì)于OFL和OVA有明顯改變,表明OVA與OFL偶聯(lián)成功。

圖1 CIP、BSA和CIP-BSA的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of CIP, BSA and CIP-BSA圖2 CIP、OVA和CIP-OVA的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of CIP, OVA and CIP-OVA圖3 OFL、OVA和OFL-OVA的紫外光譜Fig.3 UV spectrum of OFL, OVA and OFL-OVA

2.2 多克隆抗體性能測(cè)定

如圖4～5所示,1、2號(hào)兔多克隆抗體異源包被檢測(cè)、同源包被檢測(cè)的效價(jià)抑制曲線。其中粉色線代表異源包被檢測(cè)曲線,黑色線代表同源包被檢測(cè)曲線。1、2號(hào)兔多克隆抗體,同源包被檢測(cè)的抑制率均高于異源包被檢測(cè),而2號(hào)兔多克隆抗體的異源包被檢測(cè)抑制率又比1號(hào)兔多克隆抗體高。故選用同源包被檢測(cè)以及2號(hào)兔多克隆抗體進(jìn)行方法建立實(shí)驗(yàn)。

圖4 1號(hào)兔多克隆抗體對(duì)CIP的效價(jià)抑制曲線

圖5 2號(hào)兔多克隆抗體對(duì)CIP的效價(jià)抑制曲線

2.3 適宜包被濃度及抗體稀釋倍數(shù)的確定

棋盤滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,選用吸光值A(chǔ)450 nm在1.0～1.5之間的包被原濃度及抗體稀釋倍數(shù)組合[16]。選用對(duì)CIP抑制率較高的(2 000、4 000)(4 000、4 000)(8 000、4 000)3個(gè)組合,建立CIP抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 不同包被濃度及抗體稀釋倍數(shù)條件下對(duì)環(huán)丙沙星的抑制率

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

3個(gè)不同條件下抗體對(duì)環(huán)丙沙星的檢測(cè)性能如圖6和表2所示。當(dāng)包被原稀釋8 000倍,抗體稀釋倍數(shù)為4 000倍時(shí),對(duì)CIP檢測(cè)靈敏度最高,IC50為0.16 ng/mL,檢測(cè)限LOD為0.012 ng/mL。故選用(8 000、4 000)組合。

圖6 不同包被濃度條件下對(duì)環(huán)丙沙星檢測(cè)的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)對(duì)比

2.5 交叉實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,除諾氟沙星外,其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均在15%以下,表明抗體可用于環(huán)丙沙星和諾氟沙星的特異性檢測(cè)。

表3 抗體與9種氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)

續(xù)表3

2.6 添加回收試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,該方法對(duì)魚肉及雞蛋樣品中環(huán)丙沙星的添加回收率在80%～110%之間,整體回收率在合理范圍內(nèi),可用于實(shí)際樣品中環(huán)丙沙星殘留的檢測(cè)。

表4 環(huán)丙沙星添加回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究采用活潑酯法制備免疫原環(huán)丙沙星-BSA、同源包被原環(huán)丙沙星-OVA和異源包被原氧氟沙星-OVA,通過(guò)紫外掃描判斷偶聯(lián)成功,利用免疫原免疫動(dòng)物,純化后得到多克隆抗體。

用ELISA法檢測(cè)抗體,發(fā)現(xiàn)同源包被抗原比異源效果好,推測(cè)是因?yàn)檠醴承堑倪哙夯线B有碳鏈,在與抗血清結(jié)合的過(guò)程中氧氟沙星哌嗪基碳鏈會(huì)影響分子整體的電荷分布情況,使得抗原抗體結(jié)合部位的環(huán)外氧電荷密度降低,從而降低了與抗體的結(jié)合能力。

對(duì)ELISA反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,在最優(yōu)條件下,該檢測(cè)方法對(duì)環(huán)丙沙星的檢測(cè)靈敏度IC50為0.160 ng/mL,檢測(cè)限為0.012 ng/mL,遠(yuǎn)低于WHO的限量標(biāo)準(zhǔn)1 ng/mL,是一種極為靈敏的環(huán)丙沙星快速檢測(cè)方法。

該抗體與大部分環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率(CR)在15%以下,具有較強(qiáng)的特異性。其中,諾氟沙星的CR大于100%,可能是因?yàn)榕cN連接的碳鏈比三元環(huán)更容易吸引正電荷,從而使結(jié)合部位環(huán)外氧電荷密度高,結(jié)合更加緊密。其他結(jié)構(gòu)的CR均低于15%,推測(cè)恩諾沙星的哌嗪基上有碳鏈,使得分子整體的電荷分布遠(yuǎn)離結(jié)合部位,環(huán)外氧電荷密度低,結(jié)合不緊密;普盧利沙星有N、S雜環(huán)和含O雜環(huán),降低了結(jié)合部位的環(huán)外氧電荷密度;如氟沙星中S的得電子能力比環(huán)丙沙星的O強(qiáng);莫西沙星兩個(gè)含N雜環(huán)對(duì)電子的吸引力更高;萘啶酸分子量較小,沒(méi)有標(biāo)志性剛性結(jié)構(gòu);吡哌酸和馬波沙星二氮雜環(huán)比苯環(huán)吸電子能力強(qiáng);上述原因?qū)е逻@些結(jié)構(gòu)的CR較低。

在實(shí)際樣品檢測(cè)中,合理的添加回收率表明,該檢測(cè)方法能夠滿足日常檢測(cè)要求,可用于環(huán)丙沙星的快速檢測(cè)。結(jié)合交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)得出,本研究建立了一種能夠特異性識(shí)別環(huán)丙沙星和諾氟沙星的高靈敏度檢測(cè)方法。