李杰勤, 孟瑞瑞， 王麗華， 劉言龍， 王小雨， 劉 萍

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

褐色中脈突變體(brown midrib,bmr)是指葉脈和莖桿木質(zhì)部呈現(xiàn)棕灰或棕褐色的自然或化學(xué)突變體[1]，一般在植株生長到4～6葉時在葉脈上可見，植株完全成熟后僅在莖稈木質(zhì)部可見[2]。研究表明，葉片中脈顏色與木質(zhì)素含量和組成有著密切關(guān)系[2]，而總木質(zhì)素含量和木質(zhì)素單體的組成比例對細(xì)胞壁的可消化性影響較大[3]。因此，一般認(rèn)為褐色中脈的顏色越深，其飼用品質(zhì)也越好，褐色中脈突變體作物作為生物質(zhì)能原料，其乙醇轉(zhuǎn)化率也更高[4]。

木質(zhì)素是存在于植物體內(nèi)的天然有機(jī)大分子，其生物合成對植物生長發(fā)育有重要意義，在增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的機(jī)械支持，提高植物體水分運(yùn)輸效率及增加對病菌微生物防御中起重要作用[5-7]。已經(jīng)克隆出來的5個玉米褐色中脈突變體和3個高粱褐色中脈突變體均被證明與木質(zhì)素的生物合成相關(guān)[5]。因此，研究褐色中脈突變體的木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)酶基因，能夠更好地了解褐色中脈突變體的產(chǎn)生規(guī)律和木質(zhì)素生物合成及調(diào)控機(jī)理。

本研究總結(jié)了玉米(Maize)和高粱(Sorghum)褐色中脈突變體的類型、木質(zhì)素的生物合成途徑及玉米和高粱褐色中脈基因研究進(jìn)展，同時對褐色中脈突變體產(chǎn)生的原因進(jìn)行討論，以期為玉米和高粱育種應(yīng)用及褐色中脈突變體的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 玉米和高粱褐色中脈突變體的類型

1924年在玉米中發(fā)現(xiàn)了首個自然突變的褐色中脈突變體，隨后在高粱和珍珠粟中也發(fā)現(xiàn)相似的突變體[8-9]。迄今為止，在玉米中共發(fā)現(xiàn)13個突變體[1,10-13]。根據(jù)Ali等[13]的等位性測驗，可以將玉米褐色中脈(bm)突變體劃分為6個不同的等位基因(表1)bm1、bm2、bm3、bm4、bm5和bm6。其中突變體bm1～bm6分別被定位到第5、1、4、9、5和2號染色體上[14-19]。它們均為自然突變，屬于單基因隱性突變[13]。與各自野生型相比，玉米bm1、bm2、bm3、bm4、bm5不僅降低了木質(zhì)素含量還改變了木質(zhì)素的組成，而bm1、bm2、bm3、bm4、bm5只降低了木質(zhì)素含量并沒有改變木質(zhì)素的組成(表1)。

Porter等[8]、Bittinger等[20]和Sattler等[21]用甲基磺酸乙酯(MES)和硫酸二乙酯(DES)對高粱進(jìn)行化學(xué)誘變，共產(chǎn)生20個不同的突變體，通過等位性測驗，Sattler等[21]將高粱褐色中脈突變體(bmr)劃分為8種不同的等位基因(表1)，其中bmr2、bmr6和bmr12分別被定位到第2、3和7號染色體上[22-23]，而其它類型突變體并未被定位。高粱褐色中脈突變體與其野生型相比，木質(zhì)素含量明顯降低，其中高粱bmr2、bmr6和bmr12在降低了木質(zhì)素含量的同時還改變了木質(zhì)素的組成；其他類型僅木質(zhì)素含量降低，但組成并未發(fā)生改變。

表1 高粱與玉米褐色中脈突變體類型

2 木質(zhì)素類型及生物合成途徑

木質(zhì)素是存在于植物體內(nèi)的天然有機(jī)大分子，是一種由肉桂醇等單體聚合生成的酚類多聚物，木質(zhì)素沉積在木質(zhì)部導(dǎo)管和厚壁組織及韌皮部纖維中，在增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的機(jī)械支持，提高植物體水分運(yùn)輸效率及增加對病菌微生物防御具有重要作用[5-7]。木質(zhì)素的生物合成分主要分為兩步，第一步是木質(zhì)素單體的合成，第二步為木質(zhì)素單體通過脫氫聚合合成高分子化合物[24]。木質(zhì)素單體是由苯丙氨酸至少通過11種不同的反應(yīng)途徑衍生而成[25]。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(PAL)作用下通過非氧化脫氨生成反式肉桂酸，肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)在上一步的反應(yīng)產(chǎn)物反式肉桂酸催化下生成對羥基香豆酸。對羥基香豆酸在香豆酸-3-羥化酶(C3H)、香豆酸-3-羥化酶(COMT)、阿魏酸-5-羥化酶(F5H)等酶作用下逐步生成咖啡酸、阿魏酸、5-羥基阿魏酸和芥子酸等羥基苯乙烯酸。4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)把這些不同結(jié)構(gòu)的羥基苯乙烯酸乙?；蓪?yīng)的羥基肉桂酰-CoA酯，各類羥基肉桂酰-CoA在肉桂酰CoA還原酶(CCR)作用下生成相應(yīng)的肉桂醛，肉桂醇脫氫酶(CAD)在木質(zhì)素單體合成的最后一步起作用，催化上一步產(chǎn)物肉桂醛生成相應(yīng)的肉桂醇，肉桂醇會在漆酶和過氧化酶的作用下聚合生成各種木質(zhì)素[26](圖1)。高等植物的木質(zhì)素主要可以分為3類：對-羥苯基木質(zhì)素(H-木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)。H-木質(zhì)素來源于松柏醇，G-木質(zhì)素來源于芥子醇，而S-木質(zhì)素來源于對羥基香豆醇[27]。木質(zhì)素生物合成途徑的變化導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低和組成成分改變，從而使玉米和高粱產(chǎn)生褐色中脈突變體。

圖1 木質(zhì)素生物合成途徑

3 玉米褐色中脈突變體(bm)基因克隆

玉米褐色中脈突變體bm1～bm6中，bm1～bm5已經(jīng)被證明與木質(zhì)素生物合成直接或間接相關(guān)。其中bm1編碼CAD基因，bm2編碼MTHFR基因，bm3編碼COMT基因，bm4編碼FPGS基因，而bm5編碼4CL基因(表2)。

1995年，Vignols等[28]克隆了第一個玉米褐色中脈基因bm3，即編碼咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因(COMT)。COMT是進(jìn)化上保守的甲基轉(zhuǎn)移酶家族的成員，其在木質(zhì)素合成中的作用在單子葉植物和雙子葉植物中均有記載[28]。在木質(zhì)素生物合成途徑中，COMT將S-腺苷-蛋氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇上，從而生成相應(yīng)的芥子醛和芥子醇(圖1)。Vignols等對玉米bm3兩個等位基因突變體進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)其中一個等位基因是因為COMT基因內(nèi)含子編碼區(qū)的連接處插入了一個與B5元件同源的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，而造成COMT活性喪失，而另一個則是因為部分COMT基因的缺失[28]。

表2 玉米和高粱褐色中脈突變體基因克隆研究進(jìn)展

隨后，Halpin等[29]通過同樣的方法，克隆了玉米褐色中脈基因bm1，即編碼肉桂醇脫氫酶(CAD)基因，bm1類型的重要特征是莖桿木質(zhì)部CAD活性的喪失,與野生型相比，bm1的總木質(zhì)素含量下降約20%，木質(zhì)素的組成也發(fā)生了變化。在木質(zhì)素合成途徑中，CAD以NADPH為輔助因子，催化肉桂醛生成相應(yīng)的醇(表2)。bm1突變體中的對羥基苯基(H)、愈創(chuàng)木基(G)和丁香基(S)都顯著減少，并增加了松柏醛和芥子醛以代替其相應(yīng)的醇。bm1的蛋白提取物中，ZmCAD2蛋白顯著降低，證明了玉米bm1編碼玉米ZmCAD2。

2014年,Tang等[16]利用候選基因法克隆出bm2基因，酵母互補(bǔ)實驗證明bm2編碼亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，參與關(guān)鍵甲基供體S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的形成，SAM是COMT和CCOAOMT的甲基供體，把MTHFP和木質(zhì)素生物合成聯(lián)系起來。與其野生型相比，bm2突變體積累的木質(zhì)素含量降低，組成也發(fā)生改變,降低的木質(zhì)素主要為G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素。

2015年，Li等[17]利用物理定位法克隆了bm4基因，通過酵母互補(bǔ)實驗證明bm4編碼功能性FPGS，bm4突變體導(dǎo)致木質(zhì)素含量下降和木質(zhì)素中丁香基(S)和愈創(chuàng)木基(G)比值升高。玉米bm4突變體的發(fā)現(xiàn)證明了FPGS在木質(zhì)素生物合成中的作用。

Haney等[14]鑒定出bm5基因，Mechin等[18]對bm5進(jìn)行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)玉米bm5突變體中G-木質(zhì)素含量顯著下降，H-木質(zhì)素含量明顯提高，而對S-木質(zhì)素的生物合成影響不大。隨后，Xiong等[30]通過MutMap基因定位法，確定bm5基因座編碼一個木質(zhì)素單體生物合成途徑關(guān)鍵酶之一：4-香豆酸：輔酶A連接酶(Zm4CL1)。bm5突變體測序分析發(fā)現(xiàn)，4CL活性的降低是由于轉(zhuǎn)座子的插入。Zm4CL1基因突變主要影響玉米木質(zhì)化組織中G-木質(zhì)素的生物合成和可溶性阿魏酰衍生物的積累，但不影響玉米的生長發(fā)育。此外，bm5突變體的中性洗滌纖維消化率和細(xì)胞壁糖化效率均顯著提高。bm5突變體的抗逆性降低表明Zm4CL1是細(xì)胞壁工程的一個優(yōu)良靶點(diǎn)，對該基因的遺傳操作將有利于農(nóng)作物秸稈和秸稈的利用[30]。

4 高粱褐色中脈突變體(bmr)基因克隆

在已知的8個不同類型的高粱褐色中脈突變體中，bmr2、bmr6和bmr12已被鑒定，并參與木質(zhì)素的生物合成途徑。它們分別編碼木質(zhì)素單體生物合成途徑中4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)[22,31-32](表2)。

2003年Bout等[31]利用候選基因法從高粱中克隆了首個褐色中脈基因，結(jié)果顯示，bmr12、bmr18和bmr26都為編碼COMT的等位基因上出現(xiàn)點(diǎn)突變而使COMT基因失活。在木質(zhì)素生物合成途徑中，COMT優(yōu)先催化木質(zhì)素合成途徑中的5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化生產(chǎn)芥子醛和芥子醇，參與S-木質(zhì)素的形成。Palmer等[33]研究發(fā)現(xiàn)，COMT活性降低降低了S-木質(zhì)素的含量并增加了5-OH木質(zhì)素含量。

2010年，Sattler等[34]發(fā)現(xiàn)bmr6突變體中木質(zhì)素3種亞基：對羥基苯基(H)、愈創(chuàng)木基(G)和丁香基(S)均減少。隨后Li等[17]克隆出bmr6基因，基因互補(bǔ)實驗證明bmr6編碼肉桂酸脫氫酶(CAD2)，CAD是乙醇脫氫酶超家族的一員，在木質(zhì)素生物合成途徑中，利用NADPH作為輔助因子將對羥基肉桂醛還原生成相應(yīng)的醇[32,35]。與野生型相比，bmr6突變體中木質(zhì)素含量明顯下降，但醛和多糖含量升高，表明bmr6細(xì)胞壁中醛和多糖取代了木質(zhì)素單體(香豆醇、松柏醇和芥子醇)[17]。

2012年，Saballos等[22]克隆出bmr2基因，實驗證明bmr2編碼木質(zhì)素生物合成途徑中的4-香馬酸：輔酶A連接酶(4CL)。與野生型相比，高粱bmr2降低了木質(zhì)素的含量，同時木質(zhì)素組成的也發(fā)生了變化。bmr2突變體的木質(zhì)素顯示愈創(chuàng)木基和丁香基殘基均減少。

到目前為止，已經(jīng)鑒定出8個褐色中脈基因，5個在玉米中，3個在高粱中。其中bm1和bmr6,bm3和bmr12,bm5和bmr2代表了玉米和高粱的3個同源基因座，分別編碼CAD、COMT和4CL基因(表2)，并參與木質(zhì)素的生物合成。而bm2和bm4通過影響COMT和CCoAOMT合成所需的甲基供體SAM而被并入木質(zhì)素生物合成途徑中(圖1)。

5 褐色中脈突變體研究過程中存在的問題和展望

隨著研究的不斷深入，褐色中脈突變體相關(guān)基因逐步被克隆出來。但現(xiàn)在仍然有許多難題亟待解決。比如,褐色中脈突變體產(chǎn)生褐色中脈的原因尚未清楚。最初的研究發(fā)現(xiàn)，褐色中脈突變體的色素沉積著局限于木質(zhì)化組織，而木質(zhì)化組織不易處理。主要是因為木質(zhì)素生物合成途徑十分復(fù)雜，過程中涉及十幾種酶系參與反應(yīng)。從理論上來說，合成途徑中任何一步受到干擾都有可能影響木質(zhì)素的產(chǎn)生。但早期生化分析表明，褐色中脈的色素沉積不是由于類胡蘿卜素、花青素、黃酮、單寧或黃酮醇的積累[1]。有趣的是，當(dāng)木質(zhì)素生物合成發(fā)生突變或受到RNA干擾技術(shù)的影響時，能夠在維管植物(從雙子葉植物到裸子植物)中觀察到木質(zhì)化組織的異常褐色染色[36-40]。這些結(jié)果表明，木質(zhì)化組織的顏色改變，是由于木質(zhì)素生物合成途徑中幾個不同步驟的中斷引起的，并不是針對于維管植物的特定的某個步驟的變化[27,36-40]。

此外，木質(zhì)素組分的特殊變化不容易與褐色色素沉積聯(lián)系起來，因為這些突變體和轉(zhuǎn)基因株系在木質(zhì)素生物合成途徑的不同步驟中受損，從而導(dǎo)致木質(zhì)素組成成分發(fā)生變化[27,36-40]。肉桂醇脫氫酶(CAD)活性受損的突變體或轉(zhuǎn)基因系是例外，其中木質(zhì)化組織呈現(xiàn)出棕色是由于肉桂醛取代肉桂醇并入木質(zhì)素中[27,37-39,41]。對于在木質(zhì)素生物合成的其它步驟中受損的突變體和轉(zhuǎn)基因株系，有人認(rèn)為顏色的改變是由于將香豆醇、松柏醇或芥子醇以外的酚類化合物并入木質(zhì)素。雖然顏色變化的確切原因尚不清楚，但褐色中脈突變體似乎是C4禾草中木質(zhì)素生物合成受損的一個良好標(biāo)志。

褐色中脈作為木質(zhì)素生物合成途徑反應(yīng)重要標(biāo)識，對研究植物木質(zhì)素生物合成及調(diào)控的相關(guān)基因具有重要意義，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種快速發(fā)展的基因編輯技術(shù)體系，具有制備簡單、靶向性強(qiáng)、成本低和脫靶率低等諸多優(yōu)勢，成功應(yīng)用到了微生物、植物和動物中[42]。在植物中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以改造植物基因組序列、定點(diǎn)修飾目標(biāo)基因、驗證基因功能[43-47]。目前為止，除4CL(bm5和bmr2)、COMT(bm3和bmr12)、CAD(bm1和bmr6)、MTHFR(bm2)和FPGS(bm4)之外，木質(zhì)素生物合成途徑其他酶相關(guān)的褐色中脈突變體未見報道，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對木質(zhì)素生物合成途徑中的其他基因進(jìn)行定向敲除，是用來研究褐色中脈突變體與植物木質(zhì)素生物合成及調(diào)控相關(guān)基因的一種新思路。