姚文豪， 陳志英， 王 杰， 徐 魏， 李文陽

(安徽科技學院 農(nóng)學院，安徽 鳳陽 233100)

玉米是世界上重要的糧食作物之一,也是我國三大主要糧食作物之一,對保證國家糧食安全有著重要的作用[1-2]。與此同時,我國對于玉米的需求量不斷增長，消費量從2010/2011年度的1.92億t增長至2019/2020年度的2.96億t,增長54%,年均增長5.1%。我國對玉米種子的需求量不斷增加,貯藏問題顯得額外重要[3-4]。種子從收獲后即開始發(fā)生劣變和老化,老化種子表現(xiàn)為發(fā)芽力和活力下降，細胞膜損傷，生理特性改變，遺傳完整性變差,最終失去生命力和種用價值[5-6]。高活力的種子對玉米質量與產(chǎn)量有著很大的影響[7]。確保玉米種子貯藏后的活力至關重要，溫度是決定玉米貯藏活力大小的一個關鍵外部因素,脂質過氧化被公認是導致種子陳化變質的最主要因素,而脂肪氧化酶是脂質降解的關鍵酶[8],SOD、POD和CAT是植物體內的抗氧化酶系統(tǒng)[9],低溫貯藏下的SOD、POD和CAT活性高于常溫貯藏下的酶活性,與室溫貯藏相比低溫貯藏有利于維持種子活力[10]。除此之外,品種本身的生理特性也是影響種子活力的另一重要因素[11-12]。常溫條件下,玉米種子種胚大,呼吸旺盛,同時胚部脂肪含量高,容易酸敗,與常溫貯藏相比,低溫貯藏下種子代謝弱,消耗貯藏物質少,有利于貯藏物質的積累,有利于種子活力的保持[10,13]。

因此,分析玉米種子在低溫貯藏環(huán)境中的內在變化與常溫環(huán)境中的區(qū)別,對探究玉米種子低溫貯藏的內在機理變化,提高貯藏種子的活力有著重要的意義。隨著轉錄組測序技術在農(nóng)業(yè)科學上的不斷發(fā)展[14]，可以對玉米的轉錄組序列結構進行解釋和功能分析,從而揭示玉米植株內部的生物抗性[15]。本試驗通過計算常溫和低溫貯藏下玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)來比較兩種不同貯藏溫度下種子活力大小,并通過選擇常溫和低溫貯藏下的玉米種子為材料，利用RNA-sep轉錄組測序方法,篩選出差異基因,通過KOG注釋、GO分類、KEGG注釋分析,從分子水平上為玉米低溫和常溫貯藏時內部機理變化所產(chǎn)生的差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

以蠡玉166為供試材料。將種子于2020年6-8月分別放置于室溫貯藏(對照,Control)和低溫(0～4 ℃)貯藏(Low temperature condition)。將不同溫度貯藏條件下種子進行標準發(fā)芽試驗,人工氣候箱中25 ℃,RH95%,其中12 h光照，12 h黑暗。3次重復,每重復50粒,濕沙床在消毒后進行標準發(fā)芽實驗,3 d后計算發(fā)芽勢,7 d后計算出發(fā)芽率并進一步計算出發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽勢=(第3天種子發(fā)芽數(shù)/試驗種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽率=(第7天種子發(fā)芽數(shù)/試驗種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt);

活力指數(shù)(VI)=GI×S;

式中,Gt為t時間種子發(fā)芽數(shù),Dt為相應發(fā)芽時間;S為第7天幼苗長度。

取7 d后的幼苗,用液氮將冷凍管中實驗材料急速冷凍,保存于-80 ℃下。試驗樣品委托上海生工生物工程公司進行檢測。

1.2 測定項目及方法

使用FastQC 0.11.2軟件對各個樣本測序的原始數(shù)據(jù)進行質量評估;使用StringTie-1.3.3b軟件對每個樣本進行組裝;使用DEGseq 1.26.0軟件進行組間差異表達分析[16]。設置參數(shù):qValue<0.05,且差異倍數(shù)|FoldChange|>2。采用topGO 2.24.0進行GO富集分析。使用ClusterProfiler 3.0.5進行KEGG通路和KOG分類富集分析?；诨蚬δ芨患治鼋Y果。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對玉米種子活力的影響

由表1可知,低溫貯藏種子在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)分別高出常溫種子8%、12%、56.60%,說明低溫條件更有利于種子活力的保持。

表1 不同貯藏條件下玉米種子活力的變化

2.2 測序數(shù)據(jù)質量分析

由表2可以看出,2處理各重復樣品測序Q20 Bases Ratio>98%,堿基百分比Q30 Bases Ratio>94%,52.74%≤GC Bases Ratio≤56.25%,證明數(shù)據(jù)可行性高,可作為后續(xù)的分析依據(jù)。

表2 樣本QC數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 差異表達基因的篩選

為了檢測基因表達在貯藏條件下對玉米種子發(fā)芽率降低后幼苗的影響,設置參數(shù):qValue<0.05,且差異倍數(shù)|FoldChange|>2,作為顯著差異的表達基因。低溫貯藏的玉米種子與自然貯藏狀態(tài)下的玉米種子處理間篩選出差異基因4個,其中,上調基因3個,下調基因1個(圖1)。

圖1 不同貯藏方式差異表達基因比較

2.4 差異表達基因的KOG注釋

由圖2可知,低溫貯藏的種子與自然貯藏狀態(tài)下的種子處理在KOG注釋分析中,有19 656個KOG功能得到注釋,無富集化表達功能,低溫與常溫對照無明顯差異。

圖2 差異表達基因KOG功能分類圖

2.5 差異表達基因的GO分類

如圖3所示，在GO分析中低溫貯藏的種子與自然貯藏狀態(tài)下的種子處理之間,在生物過程中應激反應、代謝過程、細胞過程3個亞類存在差異,差異基因各1個;細胞過程中細胞、細胞部分、細胞器3個亞類存在差異,差異基因各1個;分子功能中結合成分存在差異,差異基因1個。

圖3 差異基因GO注釋分類柱狀圖

2.6 差異表達基因KEGG注釋分析

如圖4顯示,在KEGG注釋分析中有機系統(tǒng)的環(huán)境適應組分存在顯著差異,包含差異基因4個;其它組分均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。低溫貯藏的LY166種子與自然貯藏狀態(tài)下的LY166種子處理的KEGG的通路分析表明植物病原菌互作P<0.01達到極顯著水平,表明貯藏條件影響植物病原菌互作過程,降低相關基因表達量,最終不利于種子萌發(fā)后幼苗的生長(表3)。

圖4 差異基因KEGG注釋分類柱狀圖

表3 不同貯藏條件下玉米種子差異基因KEGG通路分析

3 結論與討論

與常溫對照相比低溫貯藏更有利于維持種子活力。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標一直作為眾多研究者探討種子活力和壽命的重要指標[17-18]。轉錄組測序技術的應用很大程度上推動了植物分子水平方面的研究[19]。RNA-Sep是一種在轉錄水平上更為精確的測定分析方法，其通量高、分辨率高、靈敏度高且不受物種限制[20]。本研究對自然貯藏和低溫貯藏玉米種子,萌發(fā)幼苗進行芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的計算比較以及RNA-Sep測序分析。

試驗研究結果表明,低溫貯藏下的玉米種子在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)上顯著高于常溫對照種子,發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)分別高出8%、12%、56.60%。低溫貯藏有利于保持玉米種子中SOD、POD和CAT酶的活性,有利于抑制細胞內所發(fā)生的脂質過氧化作用和清除過量累計自由基,維持種子活力[10,21-22]。RNA-Sep測序分析結果表明,玉米轉錄組共獲得4個差異基因,3個上調基因,1個下調基因。在KEGG代謝途徑分析中,植物-病原互作相關代謝途徑表達明顯上調。王藝璇等[23]在番茄低溫響應WRKY轉錄因子的鑒定和分析中指出低溫脅迫能夠誘導水楊酸(SA)活性氧(ROS)和茉莉酸(JA)的產(chǎn)生。Kasote等[24]在西瓜枯萎病敏感和抗性植株在植物與病原菌互作中激素和代謝產(chǎn)物的反應中研究表明,植株在接種尖孢鐮刀菌(FON)后第8天,植株中水楊酸(SA)水平顯著高于對照植株。說明在低溫貯藏下有利于植株體內有機酸的生成,提高植株與病原菌的互作能力。

嘌呤代謝途徑明顯下調。Fujihara等[25]發(fā)現(xiàn)植物衰老和種子發(fā)芽常有大量尿酸的積累。表明低溫貯藏條件下的種子尿酸等物質的基因表達受到抑制,可以減緩種子衰老,抑制發(fā)芽,進一步從分子水平上為玉米種子低溫貯藏和常溫貯藏時內部機理變化所產(chǎn)生的差異提供參考。