曹小漢， 鄧賢會， 毛惠敏， 殷丹丹， 閆 歡， 萬文陽， 任莉萍

(阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037)

荷花(Nelumbonucifera)為蓮科蓮屬多年生挺水植物,是我國十大傳統(tǒng)名花中唯一的水生花卉。荷花在我國有3 000多年的栽培歷史,具有很高的觀賞價值、藥用價值及文化價值[1-3]。荷花喜靜水,多分布于淡水湖泊集中分布的地區(qū),耐鹽能力差[4];喜溫,不耐寒,栽植季節(jié)的氣溫在18 ℃以上[5];喜光,極不耐蔭,弱光下生長緩慢開花遲[6]。

轉錄因子通過激活或抑制下游靶基因的表達,在生物的生長發(fā)育、激素信號轉導和逆境脅迫應答中發(fā)揮著重要的調控作用。SBP(SQUAMOSA promoter binding protein)轉錄因子為植物所特有,又被稱為SPL(SQUAMOSA promoter binding protein llike)蛋白,該家族具有高度保守的SBP結構域,該結構域由74個氨基酸構成,保守結構域包含3個特征性結構,其中有2個鋅指結構,還有1個核定位信號結構[7-8]。研究表明,SBP轉錄因子參與葉片發(fā)育、花的形成、發(fā)育階段轉變、果實成熟、植物育性以及激素、光周期、生物和非生物等各種脅迫響應[9]。水稻共有19個SBP基因,OsSPL16調控水稻谷粒的形狀、大小和品質[10],OsSPL14在營養(yǎng)生長階段通過與miR156相互作用調控水稻分蘗[11]。柑橘CclSBP7促進開花且參與開花過程[12];菠蘿中SBP基因家族響應冷、熱、鹽和干旱等非生物脅迫[13]。

自SBP蛋白首次在金魚草中發(fā)現(xiàn)后[14],SBP轉錄因子家族已經(jīng)先后在擬南芥[15]、水稻[16]、小麥[17]、大麥[18]、谷子[19]、狼尾草[20]、茶樹[21]、楊樹[8]、黑胡椒[7]等多個物種中進行了全基因組水平的鑒定和分析,而荷花SBP基因家族的研究尚未見報道。本研究在全基因組水平上利用生物信息學手段對荷花SBP基因家族進行鑒定、基本理化性質分析、保守結構域分析、系統(tǒng)進化分析、染色體定位分析、順式作用元件分析及組織表達模式分析,為闡明荷花SBP基因家族成員在調控生長發(fā)育及脅迫應答等方面的生物學功能提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

荷花SBP蛋白序列來源于荷花基因組數(shù)據(jù)庫the Nelumbo Genome Database;擬南芥SBP蛋白序列來源于數(shù)據(jù)庫TAIR。

1.2 實驗方法

從Pfam數(shù)據(jù)庫下載SBP保守結構域的HMM-Hidden Markov Model文件PF03110,采用HMMER 3.0軟件鑒定SBP蛋白。利用SMART預測荷花SBP蛋白的保守結構域;利用DNAMAN軟件篩除重復序列,最終獲得荷花所有的SBP基因家族成員。

利用Expasy計算蛋白質分子量和理論等電點、不穩(wěn)定性指數(shù)、親水性總平均值。利用在線網(wǎng)站Softberry對荷花SBP蛋白進行亞細胞定位。

使用Clustal X軟件對荷花SBP蛋白進行多序列比對,并將結果提交GeneDoc 2.7進行優(yōu)化;利用TBtools對SBP基因家族的基因結構進行可視化;利用MEME分析荷花SBP保守基序;利用MEGA 7.0軟件(鄰接法,Bootstrap設為1 000次)構建系統(tǒng)進化樹;利用Plant CARE在線數(shù)據(jù)庫鑒定啟動子區(qū)的順式作用元件。從荷花基因組數(shù)據(jù)庫獲取轉錄組數(shù)據(jù),生成10組荷花不同發(fā)育階段的組織特異性表達數(shù)值;對同一組織的多個樣品數(shù)據(jù)取均值后采用log2(FPKM+1)對數(shù)據(jù)進行轉換,用TBtools軟件創(chuàng)建熱圖。

2 結果與分析

2.1 荷花NnSBP基因家族的鑒定及理化性質分析

基于荷花基因組數(shù)據(jù)庫,最終鑒定出20個荷花SBP基因,分別命名為NnSBP1～NnSBP20(表1)。理化性質分析表明,SBP蛋白長度為189～1 085 aa;對應的蛋白質相對分子質量為21 404.02～120 066.40 Da,平均值為65 734.98 Da;SBP蛋白的等電點為5.81～9.38,均值為8.14,表明家族中80%的SBP蛋白呈弱堿性(表1)?？偲骄杷詾?1.165～-0.322,該家族成員均為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)在45.94～80.69之間,說明該家族成員均為不穩(wěn)定蛋白(Instability Index>40)。經(jīng)亞細胞定位預測,16個荷花SBP蛋白定位于細胞核,另外4個蛋白定位在細胞外。

表1 荷花SBP轉錄因子家族基因基本信息

2.2 荷花SBP基因家族的進化分析

為了解荷花SBP蛋白與擬南芥SBP蛋白的系統(tǒng)進化關系,首先將荷花SBP蛋白序列和擬南芥SBP蛋白序列進行多序列比對,然后利用MEGA 7.0對構建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)進化樹亞組的分類標準,若進化樹中成員位于同一聚類分支,則被認為具有較近的親緣關系,即視為同一個亞組。結果表明,20個荷花SBP蛋白共分為8個亞組。Group 6亞族成員個數(shù)最多,有8個成員,包括4個荷花SBP蛋白和4個擬南芥SBP蛋白;其次是Group 1亞族,包括4個荷花SBP蛋白和2個擬南芥SBP蛋白;Group 4亞族和Group 5亞族各包括4各成員;Group 2亞族、Group 3亞族和Group 8亞族各包括3個成員(圖1)。

圖1 荷花SBP蛋白的系統(tǒng)進化分析

2.3 荷花SBP轉錄因子家族的蛋白質保守基序分析

通過對荷花SBP蛋白進行多序列比對,利用GeneDoc對比對結果進行作圖,結果表明所有荷花SBP蛋白序列均包含3個保守結構域,2個鋅指結構和1個核定位信號(圖2)。利用MEME在線分析20個荷花SBP蛋白序列,共鑒定出10種不同的保守基序(圖3)。參照系統(tǒng)進化樹分類,不同分支的SBP蛋白含有Motif的數(shù)目和種類差異較大(圖3 B):Group 6成員中NnSBP3和NnSBP4僅包含3種基序;Group 1、Group 2、Group 7和Group 6(NnSBP1和NnSBP17)包含4種基序;Group 3含有5種保守基序;Group 8含有7種保守基序;Group 4和Group 5含有10種保守基序。

2.4 荷花SBP基因家族在染色體上的分布

從基因組數(shù)據(jù)庫下載荷花SBP基因染色體定位信息,繪制染色體定位分布圖。結果表明,荷花SBP基因在染色體上的分布不均勻,20個基因分布于8條染色體上,染色體3上分布5個基因,分布最多;染色體1和4,分布4個基因;染色體6分布3個基因,染色體2、5、7、8均各分布1個基因。

圖2 荷花SBP蛋白保守結構域分析

圖3 荷花SBP轉錄因子的系統(tǒng)進化及保守基序分析

圖4 荷花SBP基因的染色體定位

2.5 荷花SBP基因的順式作用元件分析

啟動子序列分析表明,荷花SBP基因家族啟動子元件共分為5個類型,分別為光響應元件、厭氧誘導元件、分生組織表達元件、相關激素響應元件、脅迫響應元件(表2)。激素響應元件種類較多,包括赤霉素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、脫落酸響應元件、生長素響應元件和水楊酸響應元件,說明它們可能通過響應不同的激素信號,在荷花生長發(fā)育和脅迫響應中起不同的調控作用。

表2 荷花SBP基因順式作用元件分析

2.6 荷花SBP基因家族的表達分析

為了進一步分析荷花SBP基因在發(fā)育過程中的作用,對荷花SBP基因在不同組織(種皮、子葉、根莖、節(jié)間、葉柄、成熟花托、花瓣、授粉心皮、成熟雄蕊)的表達情況進行聚類分析(圖5)。根據(jù)圖5可以將荷花SBP基因在不同組織中的表達情況大致分為四類:第一類基因(NnSBP4、NnSBP7、NnSBP10、NnSBP13、NnSBP16)在每種組織中都表現(xiàn)為較高表達水平;第二類基因(NnSBP2、NnSBP6、NnSBP12、NnSBP15、NnSBP18、NnSBP19、NnSBP20)在各類組織中都表現(xiàn)為較低表達水平;第三類基因(NnSBP9、NnSBP11、NnSBP14)在多種組織中都表現(xiàn)為較高表達水平;第四類基因(NnSBP1、NnSBP3、NnSBP5、NnSBP8、NnSBP17)僅在少數(shù)組織中表現(xiàn)為較高表達水平。有趣的現(xiàn)象是,除了NnSBP2外的所有NnSBPs在成熟花托和授粉心皮中均表現(xiàn)為較高表達水平。

圖5 荷花SBP基因在不同組織中表達分析

3 結論與討論

植物SBP轉錄因子不僅參與植物成花途徑、生長發(fā)育的的調控[22],還在植物響應非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用,包括過量的銅離子脅迫、鹽脅迫、溫度和干旱脅迫[23-24],另外,還對花青素的生物合成產(chǎn)生負調控作用[25-26]。因此,在全基因組水平上對荷花SBP基因家族進行生物信息學及表達模式分析,為深入探討SBP基因家族成員在荷花生長發(fā)育及脅迫響應的調控功能研究中提供理論基礎。

目前,許多重要植物已經(jīng)開展了SBP基因家族的研究,擬南芥、水稻和番茄的SBP轉錄因子家族成員較少,不到20個,而茶樹、獼猴桃等成員則較多,多于20個[27]。本研究在全基因水平上共鑒定出20個荷花SBP基因。荷花SBP蛋白的等電點介于5.81～9.38之間,表明大部分NnSBP蛋白富含堿性氨基酸,可能會在酸性亞細胞環(huán)境發(fā)揮作用,這與杜仲[27]、黃瓜[28]、大麥[18]的SBP成員蛋白性質基本一致。所有荷花NnSBP蛋白均含有的2個鋅指結構,推測其能特異識別SQUAMOSA (SQ-UA)啟動子,而位于C端的核定位信號區(qū)域則能夠指導蛋白進入細胞核行使功能。從系統(tǒng)發(fā)育分析中可知,荷花和擬南芥的SBP成員可以分為8個類,相同類型的基因具有相似的基因結構和基序。通過順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),除了光響應元件、分生組織表達元件外還包括多個激素響應元件和脅迫響應元件,說明它們可能通過響應不同的激素信號,在植物生長發(fā)育和脅迫響應中具有重要的調控作用,這與谷子[19]、茶樹[29]預測結果一致。