張?zhí)N哲，馬雯，李聰，李森，袁耀武

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001）

0 引 言

在酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）中，包被環(huán)節(jié)是影響實驗準確性及可重復性的關鍵因素之一。目前，一些非蛋白類小分子半抗原的包被通常先與蛋白載體共價聯(lián)接制備偶聯(lián)物[1-6]，過程繁瑣。小分子半抗原還可以采用另外一種包被方式，即半抗原自身基團簡單修飾后直接與氨基化或醛基化的酶標板通過化學鍵聯(lián)接達到包被目的[7-10]，過程較為簡單，而且可以排除載體蛋白引起交叉反應的風險，目前這種包被方式在文獻報導中相對較少。本研究將氯霉素半抗原采用上述兩種不同方式包被酶標板，利用間接ELISA測定鮮牛乳中氯霉素質(zhì)量濃度，并對兩種不同包被方式的測定結(jié)果進行分析比較，從而對氯霉素半抗原包被方式在實際樣品測定中的效果進行評價。

1 實驗

1.1 材料與設備

卵清蛋白OVA，氯霉素，氨基己酸，抗氯霉素氯抗體，各濃度氯霉素標準溶液，酶標記物，樣品復溶液來自氯霉素快速檢測試劑盒，JET BIOFIL酶標板，亞硝基鐵氰化鈉，乙酸乙酯，鋅粉，硫酸鋅，無水乙醇，鮮牛乳，電熱恒溫培養(yǎng)箱，離心機，酶標儀。

以下溶液本實驗室配置：磷酸鹽緩沖液PBS（pH＝7.4）；洗滌液 PBST（pH＝7.4）；碳酸鹽緩沖液 CBS（pH＝9.6）；底物溶液（OPD-過氧化氫溶液）；終止液（濃度2.0m o l/L的H2SO4溶液）。

1.2 方法

1.2.1 氯霉素半抗原的直接包被方式

氨基化氯霉素的制備、酶標板醛基化處理參照文獻[8]中的方法進行。

酶標板的包被：將氨基化氯霉素用PBS適當稀釋后加入醛基化酶標板，150μL/孔，37℃恒溫反應2 h，之后PBST洗滌3次，250μL/孔PBST洗液，每次3分鐘。

酶標板的封閉：用0.2 m ol/L的氨基己酸溶液封閉酶標板，200μL/孔，37℃恒溫反應2 h，之后PBST如上洗滌3次。

1.2.2 氯霉素半抗原的間接包被方式

氯霉素-OVA偶聯(lián)蛋白的制備：混合酸酐法，參照文獻[1]中方法。

酶標板的包被：將氯霉素-OVA偶連蛋白用CBS適當稀釋后加入酶標板，150μL/孔，37℃恒溫反應2 h，之后PBST洗滌3次，250μL/孔PBST洗液，每次3 min。

酶標板的封閉：用含質(zhì)量分數(shù)為1%的OVA的PBS溶液封閉酶標板，200μL/孔，37℃恒溫反應2 h，之后PBST如上洗滌3次。

1.2.3 兩種不同包被方式包被濃度的確定

在直接包被方式中，將氨基化氯霉素制備液用PBS溶液5倍遞進稀釋為不同質(zhì)量濃度后，按照1.2.1步驟分別包被醛基化酶標板并完成封閉過程；在間接包被方式中，將氯霉素-OVA偶連蛋白制備液用CBS溶液5倍遞進稀釋為不同濃度后，按照1.2.2步驟分別包被酶標板并完成封閉過程。不同包被濃度的孔中分別加入50μL的酶標記物、50μL的PBS溶液及50μL的氯霉素抗體工作液，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，保濕反應30 min；甩凈孔內(nèi)液體后按照1.2.1步驟洗板5次；向所有孔中加入底物溶液100μL，25℃避光反應15 min；向所有孔內(nèi)加終止溶液50μL；用酶標儀在492 nm波長下測量各孔的吸光度（OD值）。繪制吸光度與包被濃度關系曲線，通過分析比較，確定兩種包被方式的抗原包被質(zhì)量濃度。

1.2.4 含氯霉素牛乳樣品的制備及提取

含氯霉素牛乳樣品的制備：取新鮮牛乳，人為添加氯霉素，使其在牛乳中質(zhì)量濃度分別為0.05，0.2，0.8 μg/L，充分混勻。

含氯霉素牛乳樣品的提?。悍謩e量取5.0 m L添加不同質(zhì)量濃度氯霉素的牛乳樣品及對照牛乳，加入0.25 m L濃度為0.36 mol/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和0.25 m L濃度為1m o l/L硫酸鋅溶液，震蕩混合，然后在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min。避開上層油脂，移取出2.2m L的上層液至另一離心管，加入4m L的乙酸乙酯，充分震蕩5 min，然后轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min。吸取上層液體2 m L，在60℃氮氣流下吹干，用1 m L樣品復溶液溶解干燥后的殘留物，待檢用。

1.2.5 間接競爭ELISA測定樣品中氯霉素

在確定好包被濃度的兩種不同包被方式的酶標板中，分別取不同濃度的氯霉素標準液及待測樣品提取液各50μL，加到酶標板對應孔中，各孔中加入50μL的酶標記物，然后各孔中加入50μL的抗體工作液，后續(xù)反應步驟同于1.2.3。標準溶液測定吸光度值后分析重復孔吸光度值變異系數(shù)，計算百分吸光度值（百分吸光度值=B/B0×100%，B代表各濃度標準溶液的平均吸光度值，B0代表氯霉素0含量準溶液的吸光度值），繪制百分吸光度值與氯霉素質(zhì)量濃度關系的回歸曲線。待測樣品計算百分吸光度值后根據(jù)回歸曲線確定牛乳樣品中氯霉素含量，并計算各濃度樣品氯霉素回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種不同包被方式包被濃度的確定

兩種不同包被方式的間接ELISA，在抗體與酶標記物濃度一定的情況下，包被抗原濃度與結(jié)果吸光度值的關系見圖1。由圖1可以看出隨著包被抗原稀釋度的增加，兩種包被方式的吸光度值都呈現(xiàn)規(guī)律性下降趨勢，表現(xiàn)出平緩—速降—平緩的過程。曲線的速降區(qū)為與抗體反應合理的抗原濃度范圍，本試驗在速降區(qū)中部左右選擇吸光度值，兩種不同包被方式與此吸光度值對應的稀釋度作為間接競爭ELISA的包被濃度，即直接包被方式采用1：625倍稀釋的制備液，間接包被方式采用1：25倍稀釋制備液，它們對應的吸光度值均為1左右。

圖1 包被濃度對測定結(jié)果的影響

2.2 兩種不同包被方式孔間變異系數(shù)的比較

不同質(zhì)量濃度的氯霉素標準液經(jīng)間接競爭ELISA測定后，測定吸光度值并分析各濃度重復孔吸光度值的變異系數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，兩種包被方式各濃度標準液吸光度值變異系數(shù)在2.6～10.6之間，都屬于正常范圍以內(nèi)（小于15%），經(jīng)無重復雙因素方差分析對吸光度值變異系數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)兩種包被方式間比較P-value值為0.039，在0.01～0.05之間，差異顯著；各濃度組間比較P-value值遠小于0.01，差異極顯著。結(jié)果說明變異系數(shù)受到包被方式的影響，也受到樣品中氯霉素質(zhì)量濃度的影響，與間接包被方式相比，直接包被方式具有更低的變異系數(shù)。

表1 不同包被方式吸光度值變異系數(shù)的比較

2.3 兩種不同包被方式回歸曲線的比較

不同質(zhì)量濃度的氯霉素標準液經(jīng)間接競爭ELISA測定后，繪制百分吸光度值（B/B0）%與氯霉素質(zhì)量濃度關系的回歸曲線，如圖2所示。由圖2可以看出，兩種包被方式的回歸曲線都呈現(xiàn)較好的量效關系，這說明不論哪種包被方式，在通過間接競爭ELISA測定氯霉素質(zhì)量濃度時都是可行的。兩種包被方式中，百分吸光度值隨著氯霉素質(zhì)量濃度在0.025～2.025μg/L之間變化均呈現(xiàn)規(guī)律性下降趨勢，在0.075～0.675μg/L之間下降坡度最大，提示這個濃度區(qū)段是樣品中抗原最佳競爭質(zhì)量濃度范圍。直接包被方式與間接包被方式相比，曲線末端出現(xiàn)明顯向下背離趨勢，意味著直接包被方式的回歸曲線具有更大斜率，量效關系更明顯，從理論上講檢測靈敏度要高于間接包被方式，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因還需進一步試驗確定。

圖2 不同包被方式的間接競爭ELISA測定氯霉素回歸曲線的比較

2.4 兩種不同包被方式檢測結(jié)果的比較

添加不同質(zhì)量濃度氯霉素的牛乳樣品經(jīng)過提取后，利用間接競爭ELISA測定各樣品的吸光度值，計算B/B0（%）后，根據(jù)回歸曲線得出氯霉素檢出量，結(jié)果如表2所示。經(jīng)單因素方差分析，各處理組兩種包被方式氯霉素檢出量比較P-value值均大于0.05，即無顯著性差異。根據(jù)測定結(jié)果計算樣品回收率，直接包被方式各處理組樣品回收率在80.9～91之間，間接包被方式各處理組樣品回收率在85.9～94之間，經(jīng)無重復雙因素方差分析，兩種包被方式樣品回收率結(jié)果無顯著性差異，各處理組間樣品回收率結(jié)果也無顯著性差異。

表2 不同包被方式的間接競爭ELISA對牛乳樣品中氯霉素檢測結(jié)果的比較

3 討論

氯霉素是家畜疾病防治的常用藥物，如果氯霉素殘留物隨動物性食品進入人體中，會對人類健康帶來潛在危害。酶聯(lián)免疫吸附實驗可以快速檢測樣品中氯霉素的殘留，而包被環(huán)節(jié)又是酶聯(lián)免疫吸附實驗的基礎。本研究在利用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測氯霉素時，對氯霉素半抗原的兩種包被方式進行了對比分析。間接包被方式需要先制備蛋白偶聯(lián)物，過程較繁瑣；直接包被方式與間接包被方式相比，制備過程較為簡單。檢測結(jié)果經(jīng)過對比分析發(fā)現(xiàn)，直接包被方式在回歸曲線具有更大斜率，重復孔吸光度值的變異系數(shù)也相對較低，兩種包被方式在牛乳樣品中的氯霉素檢出量及測得樣品回收率方面并沒有顯著性差異，結(jié)果說明直接包被方式可以得到穩(wěn)定的包被效果，能夠用于乳類樣品中氯霉素的檢測。