張 齊， 張圣煜， 陳春旭

(安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

貴州毛峰產(chǎn)于貴州湄潭縣,又名湄潭毛峰[1],其品質(zhì)特點(diǎn)是:前苗完整婀娜,覆銀色茸毛,光彩青翠,茶香芬芳,湯色清澈翠綠,風(fēng)味醇厚,葉底碧綠鮮嫩。毛峰中具有很多酚類抗氧化性物質(zhì)如茶多酚[2-3],茶多酚可以清除人體中的自由基,起到抗氧化作用,還有延緩衰老的功效。相關(guān)研究表明[4],在不同沖泡條件(溫度、時(shí)間、液料比以及水質(zhì)等)下,茶湯的口感以及茶葉中主要的抗氧化活性物質(zhì)的浸出都有不同的結(jié)果;綠茶在液料比50∶1、溫度85 ℃、沖泡時(shí)間5 min的條件下，有較好的口感和較高的營養(yǎng)價(jià)值。

不同的沖泡方式對綠茶茶湯的抗氧化活性會產(chǎn)生影響[5-7],但目前關(guān)于沖泡條件對貴州毛峰茶湯抗氧化性特性影響的研究較少。因此,研究文以貴州毛峰茶湯對DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和二價(jià)鐵離子螯合能力為實(shí)驗(yàn)參數(shù),通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化方案探究沖泡條件對貴州毛峰茶湯抗氧化特性的影響,為茶葉資源的綜合利用提供思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

貴州毛峰(湄潭毛峰)產(chǎn)于貴州湄潭縣;1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)，硫酸亞鐵(分析純)，水楊酸，H2O2(分析純)，二氯化鐵(分析純)，菲羅嗪鈉鹽(上海泰坦科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 沖泡液料比對茶湯抗氧化活性的影響 稱取茶葉1 g于茶杯中,注入溫度為85 ℃、體積分別為40、50、60、70、80 mL的純凈水,沖泡時(shí)間為5 min,過濾得茶湯。根據(jù)抗氧化活性檢測方法,測出不同液料比對茶湯抗氧化活性的影響,得出最優(yōu)液料比。每組單因素實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取平均數(shù)。

1.2.1.2 沖泡溫度對茶湯抗氧化活性的影響 稱取茶葉1 g于茶杯中,分別注入溫度為75、80、85、90、95 ℃純凈水50 mL,沖泡時(shí)間為5 min,過濾得茶湯。根據(jù)抗氧化活性檢測方法,測定溫度對茶葉抗氧化活性的影響,確定最佳沖泡溫度。每組單因素實(shí)驗(yàn)樣本3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取3組數(shù)據(jù)平均數(shù)。

1.2.1.3 沖泡時(shí)間對茶湯抗氧化活性的影響 稱取茶葉1 g于茶杯中,注入50 mL 85 ℃純凈水,沖泡時(shí)間分別為4、5、6、7、8 min,過濾得茶湯。根據(jù)抗氧化活性檢測方法,測出時(shí)間對茶湯抗氧化活性的影響,得出最優(yōu)沖泡時(shí)間。每組單因素實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取3組數(shù)據(jù)平均數(shù)。

1.2.1.4 不同種類的水對茶湯抗氧化活性的影響 稱取茶葉1 g于茶杯中,注入50 mL 85 ℃蒸餾水、“純悅”純凈水、“農(nóng)夫山泉”礦泉水、“百歲山”礦泉水、實(shí)驗(yàn)室自來水,沖泡時(shí)間為5 min,過濾得茶湯。根據(jù)抗氧化活性檢測方法,測出不同類型的水對茶湯抗氧化活性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照DPPH自由基清除率大小進(jìn)行排序,得出最優(yōu)沖泡水的類型。每組單因素實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取3組數(shù)據(jù)平均數(shù)。

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件見表1。DPPH自由基清除率作為實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6響應(yīng)面分析軟件,得出最優(yōu)沖泡條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 抗氧化活性檢測方法 采用DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、二價(jià)鐵離子螯合能力作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，檢測方法如下。

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的檢測方法[8-9]DPPH溶解在95%乙醇中，制備0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別取不同條件沖泡的茶湯2.0 mL,加入2.5 mL的DPPH自由基溶液,充分反應(yīng),無光條件靜置30 min。在波長517 nm 處,測定茶湯的吸光度為A1;在相同條件下,將樣品溶液替換成等體積蒸餾水與DPPH溶液反應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)樣品,記錄吸光度為A;分別取不同條件沖泡的茶湯2.0 mL,加入2.5 mL蒸餾水替代實(shí)驗(yàn)試劑反應(yīng),測量的吸光度記錄為A2。計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100%

1.2.3.2 羥基自由基清除率檢測方法 分別取不同沖泡條件的茶湯2.0 mL,依次加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸、9 mmol/L H2O2各1.0 mL,在37 ℃下靜置30 min。在波長510 nm下[10-11],測定樣品吸光度記錄為A1。在相同條件下,將樣品溶液替換成等體積蒸餾水與實(shí)驗(yàn)試劑反應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)樣品,測定的吸光度記錄為A;分別取不同沖泡條件下的茶湯2.0 mL，加入3.0 mL蒸餾水,測定吸光度(A2)。計(jì)算公式如下:

羥基自由基清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100%

1.2.3.3 二價(jià)鐵離子螯合能力檢測方法 分別取不同沖泡條件的茶湯2.0 mL,加入0.1 mL、2 mmol/L FeCl2溶液,搖勻,再加入0.2、2.7 mL 5 mmol/L菲羅嗪溶液,充分接觸后,在27 ℃條件下反應(yīng)10 min。在波長562 nm下,以蒸餾水作為參照,測定的吸光度記錄為A1。在相同條件下,將樣品溶液替換成去蒸餾水與實(shí)驗(yàn)試劑反應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)樣品,測定的吸光度記錄為A0。分別取不同條件下沖泡的茶湯2.0 mL,加入3.0 mL蒸餾水替代實(shí)驗(yàn)試劑反應(yīng),測定的吸光度記錄為A2。計(jì)算公式如下:

CA=(A0-A1+A2)/A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 不同液料比對茶湯抗氧化活性的影響 由圖1可知,液料比對二價(jià)鐵離子螯合能力的影響顯著,對DPPH自由基清除率影響較小,對羥基自由基清除率的影響最小。且三者的活性指標(biāo)都與液料比呈負(fù)相關(guān),隨液料比的增加而逐漸減少。這是因?yàn)殡S液料比的增加,茶湯中的抗氧化物質(zhì)濃度降低,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳建煙等[12]研究結(jié)果一致。

羥基自由基在液料比為40∶1時(shí)清除率最高(69.82%),在80∶1時(shí)清除率最低(67.03%)。羥基自由基與另2種自由基清除率相比,差異不顯著。DPPH自由基在液料比為40∶1時(shí)清除率達(dá)到最高,為71.29%,在80∶1的液料比條件下清除率最低,為63.06%,其總體趨勢與羥基自由基清除率大致相同,只是清除率大小略有差異。二價(jià)鐵離子螯合能力在液料比為40∶1時(shí)螯合力最大,為75.71%,在80∶1的液料比條件下清除率最低,為54.88%,在3種抗氧化活性指標(biāo)中,其規(guī)律性最強(qiáng),極差最大。綜上,本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳沖泡液料比為40∶1。

2.1.2 不同溫度對茶湯抗氧化活性的影響 由圖2可知,溫度對茶湯抗氧化活性影響顯著。茶湯的羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、二價(jià)鐵離子螯合能力3種抗氧化活性指標(biāo)在75～85 ℃條件下，都隨著溫度的升高而增加,羥基自由基在75 ℃時(shí)清除率最低,為70.27%,在85 ℃清除率最高,為75.43%;DPPH自由基清除率在75 ℃具有最低的清除率，為67.77%,在85 ℃具有最高的清除率，為73.55%;二價(jià)鐵離子在75 ℃下螯合能力最低，為67.41%,在85 ℃條件下具有最高的螯合能力,為73.69%。在85～95 ℃下羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、二價(jià)鐵離子螯合能力3種抗氧化活性指標(biāo)隨著溫度的升高而降低。在95 ℃下,羥基自由基清除率下降明顯,數(shù)值為70.54%;DPPH自由基清除率下降程度在3個(gè)指標(biāo)中最小,數(shù)值為71.83%,二價(jià)鐵離子螯合能力下降趨勢呈直線,數(shù)值為69.97%。3種指標(biāo)的趨勢與米智等[13]測定茶多酚得率的結(jié)果相同,說明貴州毛峰茶湯中起抗氧化作用的主要物質(zhì)可能是茶多酚。

在以溫度為變量的條件下,對三者變化趨勢的原因分析如下:一是與茶葉的加工方式有關(guān),因?yàn)樵诟邷氐臈l件下沖泡,茶葉葉片容易打開,增加葉片與水的接觸面積,使更多的抗氧化物質(zhì)進(jìn)入茶湯。二是溫度的升高加快了物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng),加速了抗氧化物質(zhì)的溶出并進(jìn)入茶湯。若溫度持續(xù)上升,高溫則可能會破壞茶葉中的抗氧化物質(zhì)[5],導(dǎo)致其抗氧化活性降低。綜上,本實(shí)驗(yàn)得出的最佳沖泡溫度為85 ℃。

圖1 液料比對毛峰茶湯抗氧化活性的影響

圖2 溫度對毛峰茶湯抗氧化活性的影響

2.1.3 沖泡時(shí)間對茶湯抗氧化活性的影響 由圖3可知，沖泡時(shí)間對茶湯抗氧化活性也有一定的影響。其中,羥基自由基清除率在4～6 min時(shí)出現(xiàn)下降的狀態(tài),在4 min時(shí)清除率為69.50%,在6 min時(shí)清除率為67.93%,下降了1.57%,在7 min時(shí)略微提升到68.23%,在8 min時(shí)清除率又下降到了67.80%;DPPH自由基清除率在4～6 min時(shí)一直上升,在4 min時(shí)清除率為69.57%,在6 min時(shí)清除率為71.50%,而在6～8 min內(nèi)逐漸下降,在8 min時(shí)清除率為69.32%;二價(jià)鐵離子螯合能力在4～7 min時(shí)逐漸上升,從4 min的66.95%上升到7 min的69.11%,在7～8 min時(shí)又呈現(xiàn)下降趨勢,在8 min時(shí)螯合能力為63.91%。

由上述結(jié)果可知,在一定時(shí)間范圍內(nèi),茶湯的抗氧化活性是隨著時(shí)間的增加而逐漸增大,但是超過一定的時(shí)間茶湯的抗氧化活性又逐漸降低,其原因可能是隨著時(shí)間的增加,茶湯濃度上升,茶葉內(nèi)外抗氧化物的濃度差下降,使茶葉中抗氧化物質(zhì)浸出的速率小于氧化的速率,所以抗氧化活性逐漸下降[14]。綜上,本實(shí)驗(yàn)得出的最佳沖泡時(shí)間為6 min。

圖3 時(shí)間對毛峰茶湯抗氧化活性的影響

圖4 不同類型的水對毛峰茶湯抗氧化活性的影響

2.1.4 不同類型的水對茶湯抗氧化活性的影響 由圖4可知,不同類型的水對茶湯抗氧化活性影響十分顯著,且對3種抗氧化指標(biāo)有著不同的影響。在測定的條件下,用“純悅”純凈水沖泡羥基自由基的清除率最低(65.52%),用自來水沖泡羥基自由基有最高的清除率(75.03%);用蒸餾水沖泡DPPH自由基清除率最高為(78.52%),用自來水沖泡DPPH自由基清除率最低(39.22%);二價(jià)鐵離子螯合能力用蒸餾水沖泡時(shí)最低(60.54%),用“百歲山”礦泉水沖泡時(shí)其螯合能力最高(82.19%)。

由于水中影響因素過多,同時(shí)羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、二價(jià)鐵離子螯合能力3種抗氧化活性指標(biāo)的作用機(jī)理又不盡相同[15],所以會導(dǎo)致3種抗氧化活性指標(biāo)的趨勢有所差異。結(jié)合前人研究水質(zhì)對茶湯品質(zhì)的影響[16]可以發(fā)現(xiàn):沖泡用水中的內(nèi)容物越少,茶湯中各項(xiàng)指標(biāo)就越好,可能是由于沖泡用水中內(nèi)容物越多,與茶中抗氧化物質(zhì)反應(yīng)的可能性越大,使茶湯中抗氧化物質(zhì)的濃度和浸出速率變低[17]。綜上,本實(shí)驗(yàn)得出的最佳沖泡水質(zhì)為蒸餾水。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型建立 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果見表2,根據(jù)軟件Design-Expert V8.0.6處理結(jié)果,得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸方程:Y=74.25+1.72A+2.12B-2.83C-0.79AB-0.73AC-0.95BC-2.12A2-1.75B2-2.32C2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果

在回歸模型中A溫度、B時(shí)間、C液料比對DPPH自由基清除率的影響都是極顯著(P<0.000 1),F值大小反應(yīng)了3種因素的影響程度,由表3可知C>B>A,即對DPPH自由基清除率影響最大的因素是液料比,其次是時(shí)間,溫度對其影響程度最小。同理,從交互作用角度分析,BC>AB>AC,即在交互作用中,時(shí)間與液料比的交互作用對響應(yīng)值的影響最大。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件結(jié)果的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用 由圖5可知,等高線圖像呈橢圓形,曲面圖像坡度大,說明溫度和時(shí)間的交互作用顯著。從響應(yīng)面圖中可以看出，隨著溫度和時(shí)間的增加,DPPH清除率先上升后下降,且溫度和時(shí)間的彎曲程度差異不大,說明溫度和時(shí)間對清除率的影響差異性不大。在沖泡液料比為40∶1恒定時(shí),沖泡溫度87 ℃、沖泡時(shí)間6.65 min下有最大的DPPH自由基清除率。

由圖6可知,等高線圖像呈、橢圓形,且曲面圖像坡度較大。說明溫度和液料比的共同作用對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。從響應(yīng)面曲面圖中可以得知，隨著液料比和溫度的逐漸上升,DPPH清除率先上升后下降,且液料比曲線的彎曲程度大于溫度的曲線,說明液料比對清除率的影響大于溫度。在沖泡時(shí)間為6 min時(shí),沖泡溫度87 ℃、沖泡液料比40∶1下有最大的DPPH自由基清除率。

圖5 溫度和時(shí)間共同作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 溫度和液料比共同作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖7可知,等高線圖像呈橢圓形,曲面圖像坡度大,說明時(shí)間和液料比的共同作用對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。從響應(yīng)面曲面圖中可以看出隨著時(shí)間和液料比的逐漸上升,DPPH清除率先上升后下降,且液料比曲線的彎曲程度大于時(shí)間的曲線,說明液料比對清除率的影響大于時(shí)間。在沖泡溫度85 ℃恒定時(shí),沖泡時(shí)間6.65 min、液料比40∶1下DPPH自由基清除率存在最大值。

圖7 時(shí)間和液料比共同作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.3 最佳配方與驗(yàn)證 通過軟件Design-Expert V8.0.6的運(yùn)算，推出貴州毛峰最優(yōu)的沖泡條件。在液料比41.72∶1、溫度87.06 ℃、沖泡時(shí)間6.74 min下，DPPH有最高的清除率(76.55%)。為了實(shí)驗(yàn)操作的簡便性，對上述預(yù)測條件進(jìn)行優(yōu)化液料比為40∶1，溫度為87 ℃，沖泡時(shí)間為6.75 min，對優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，在該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，得出DPPH自由基清除率為77.23%。與預(yù)測值相近，說明該模型對于沖泡條件有很高的擬合程度，可以對貴州毛峰的沖泡條件進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究探究了不同沖泡條件對貴州毛峰茶湯的抗氧化活性的影響，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)沖泡條件為液料比40∶1、溫度87 ℃、沖泡時(shí)間6.75 min，DPPH自由基清除率達(dá)到最高值,為77.23%。