畢玉芳， 武月銘， 劉士琦， 錢宇芯， 劉潤輝

（華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

細菌生物被膜是由自生的胞外聚合物基質(zhì)（EPS）及內(nèi)部細菌組成的生態(tài)系統(tǒng)[1]。生物被膜可以在所有生物及非生物表面上形成，如人體組織、醫(yī)療器械、植入器械等。據(jù)統(tǒng)計，目前發(fā)達國家細菌感染中60%以上與生物被膜相關(guān)[2]。相比于浮游菌，細菌生物被膜對人體自身的免疫清除和抗生素的抵抗性大大增強。生物被膜的耐藥性約為浮游菌的10～1 000 倍[3]。藥物滲透能力差[4]、生物被膜內(nèi)部持留菌的存在[5]是抗生素清除生物被膜能力不佳的兩大主要原因。

金黃色葡萄球菌是造成導(dǎo)尿管生物被膜相關(guān)感染的主要病原體之一，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種超級細菌病原體，易導(dǎo)致難治療的感染甚至敗血癥[6]。導(dǎo)尿管相關(guān)的尿路感染常見于臨床上的留置導(dǎo)尿管操作中，與導(dǎo)尿管內(nèi)細菌生物被膜的存在密切相關(guān)。對于大多數(shù)細菌，DNA 和蛋白質(zhì)是其形成和維持生物被膜的必需成分[7]。金黃色葡萄球菌的生物被膜相關(guān)蛋白（BAP）是一種多結(jié)構(gòu)域的細胞表面錨定蛋白[8]，在細菌定植和生物被膜的發(fā)展中起著重要作用，可作為預(yù)防和清除生物被膜的靶點[9]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶對生物被膜有分散作用，但是對浮游細胞的生長無明顯抑制作用[10]。許多文獻研究了蛋白酶與不同抗生素協(xié)同對生物被膜形成的抑制和成熟生物被膜的分散作用，證明了蛋白質(zhì)降解是控制生物被膜的有效途徑[11]。蛋白酶K 是一種活性較高的絲氨酸蛋白酶，在通常情況下都很穩(wěn)定，且對蛋白質(zhì)的水解是非特異性的[12]。蛋白酶K 對生物被膜的分散作用有利于抗菌藥物在生物被膜內(nèi)部的滲透。同時，EPS 的消散會大幅減少細菌可能的二次定植，延長生物被膜感染治療的有效時間[13]。

在對抗生物被膜方面，抗生素的突出缺點是對生物被膜內(nèi)部的持留菌效果不佳，且抗生素的長期使用易加劇微生物的耐藥性，因此新型抗菌藥物的研發(fā)迫在眉睫。宿主防御肽由于其非特異性的破膜殺菌機制而在對抗持留菌方面具有突出優(yōu)勢，然而易被蛋白酶水解穩(wěn)定性差、大量制備困難、成本高、活性不顯著等缺點嚴重限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用[14]。考慮到合成成本及大量制備的需求，研究人員近年來一直致力于開發(fā)宿主防御肽模擬物，通過親水/疏水平衡的調(diào)節(jié)獲得聚合物的優(yōu)異選擇性和抗菌活性，尤其是對持留菌的高殺菌活性[15]。本課題組也一直特別關(guān)注可以快速、廉價制備的宿主防御肽模擬聚合物[16,17]。

針對生物被膜耐藥性的兩大關(guān)鍵因素，本文使用雙（三甲基硅基）胺基鋰（LiHMDS）引發(fā)的α-氨基酸N-羧酸酐（NCA）快速開環(huán)聚合方法，將叔丁氧羰基（Boc）保護的D,L-賴氨酸環(huán)內(nèi)酸酐（Boc-DLL NCA）和γ-芐基-L-谷氨酸環(huán)內(nèi)酸酐（BLG NCA）兩種單體按照6/4 的物質(zhì)的量比例投料，合成鏈長為27 的宿主防御肽模擬聚合物P（DLL-co-BLG）[16,18-21]，研究其對MRSA 的殺菌活性、殺滅持留菌的能力及殺菌機理。使用人工尿液環(huán)境中的成熟生物被膜模擬導(dǎo)尿管內(nèi)部形成的生物被膜。首先以生物被膜EPS 中的蛋白質(zhì)作為靶點，使用蛋白酶K 分散成熟生物被膜，然后施加聚合物P（DLL-co-BLG），通過蛋白酶K 和聚合物的協(xié)同作用實現(xiàn)了生物被膜的清除（圖1）。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：谷歌生物科技有限公司；MH 肉湯培養(yǎng)基：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）：上海麥克林生化科技有限公司；碘化丙啶（PI）：Sigma-Aldrich；綠色熒光核酸染色劑（SYTO 9）：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；蛋白酶K：30 U/mg，上海眾何化學科技有限公司；肌（氨）酸：東京化成工業(yè)株式會社；其他化學試劑均購于上海泰坦科技股份有限公司，使用前無進一步處理。細菌S. aureusUSA300、S. aureusATCC6538、S. aureus2904、S. aureus2802、S. aureus1306、S. aureus2202 均為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，S. aureus2902、S. aureus1921、S. aureus0811 均為普通金黃色葡萄球菌。除S. aureusUSA300 和S. aureusATCC6538 外，其余菌株菌為來自上海瑞金康復(fù)醫(yī)院的臨床分離菌株。試劑均為分析純，使用前無進一步處理。

1.2 測試與表征

核磁共振（NMR）波譜：德國Bruker 公司 AVANCE Ⅲ 400 MHz 型，重水（D2O）為溶劑。

凝膠滲透（GPC）色譜：設(shè)備配有Waters 1515 等強度HPLC 泵，Waters 2414 示差折光檢測器（RI），東曹TSKgel Alpha-3000 柱（粒徑為7 μm），東曹TSKgel Alpha-2500 柱（粒徑為7 μm），柱溫箱溫度為50 ℃，檢測器溫度為35 ℃，流動相為含10 mmol/L 溴化鋰的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），流動相流速為1 mL/min，以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）為標準樣制作標準曲線，聚合物的數(shù)均分子量（Mn）和多分散系數(shù)（?）由軟件Breeze 2 計算得出。

酶標儀：美國Molecular Devices 公司SpectraMax M2 型。

1.3 實驗步驟

1.3.1 多肽聚合物的合成 P（DLL-co-BLG）的合成路線如圖2 所示。根據(jù)文獻[16]進行LiHMDS 引發(fā)的快速NCA 開環(huán)聚合。Boc-DLL NCA 和BLG NCA 之前已被合成和表征[16]。

圖2 多肽聚合物P（DLL-co-BLG）的合成Fig. 2 Synthesis of the peptide polymer P（DLL-co-BLG）

將Boc-DLL NCA（49.1 mg, 0.18 mmol）和BLG NCA（31.6 mg, 0.12 mmol）溶解于2 mL 無水四氫呋喃（THF）中，在攪拌條件下，向反應(yīng)瓶中快速加入0.6 mL 引發(fā)劑 LiHMDS（0.1 mol/L）。攪拌5 min后，通過薄層色譜（TLC）確認反應(yīng)完成，用幾滴甲酸淬滅反應(yīng)。向反應(yīng)混合物中緩慢加入45 mL 冰石油醚（PE）以沉淀出聚合物，隨后離心收集聚合物固體。該沉淀-溶解過程循環(huán)3 次，最終得到側(cè)鏈氨基被Boc 保護的聚合物。

為了除去氨基的保護基團Boc，往側(cè)鏈被保護的聚合物中滴加2 mL 三氟乙酸（TFA），混合溶液在室溫下震蕩2 h。隨后使用氮氣將TFA 緩慢吹干，得到的油狀物用幾滴甲醇溶解。隨后向體系中加入冰甲基叔丁基醚，并離心收集脫保護后的聚合物。

1.3.2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測試S. aureusUSA300 在恒溫37 ℃搖床上以150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)好的菌液離心并用MH 培養(yǎng)基稀釋至2×105CFU/mL。聚合物的MIC 測試在96 孔板中進行。在MIC 測試之后的96 孔板的每個孔中吸取3.5 μL 液體轉(zhuǎn)移到LB 培養(yǎng)基固體培養(yǎng)皿中，菌液晾干后在37 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，通過肉眼讀取聚合物的MBC。

1.3.3 細胞質(zhì)膜去極化實驗 使用碘化-3,3′-二丙基硫雜二羰化青（DiSC3（5））進行P（DLL-co-BLG）的細胞質(zhì)膜去極化實驗。37 ℃下，S. aureusUSA300 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，隨后離心并棄去培養(yǎng)基。細菌被4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液（5 mmol/L HEPES，pH=7.4，含20 mmol/L 葡萄糖）洗滌后，在HEPES 緩沖液中稀釋至107CFU/mL。隨后將10 mL 細菌懸液與20 μmol/L DiSC3（5）一起孵育1 h。為了獲得細胞內(nèi)膜去極化實驗的細菌懸液，向DiSC3（5）孵育后的細菌溶液中添加0.1 mol/L 氯化鉀以平衡細菌外部和細胞質(zhì)的K+。在384 孔黑板中每孔加入90 μL 測試菌液，于平板閱讀器上使用激發(fā)波長622 nm、發(fā)射波長670 nm 采集熒光值，直至熒光值穩(wěn)定。最后，向每孔測試菌液中添加10 μL 聚合物溶液（此時時間記為t=0），并連續(xù)記錄熒光強度。以體積分數(shù)0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）為陽性對照，萬古霉素為陰性對照。

1.3.4 消滅持留菌測試 37 ℃下，S. aureusUSA300 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 到對數(shù)中期，隨后離心并棄去培養(yǎng)基。細菌被PBS 洗滌一次后，在MH 培養(yǎng)基中稀釋至108CFU/mL。用10 倍MIC 的環(huán)丙沙星對S. aureusUSA300 刺激18 h 后，收集S. aureusUSA300 的持留細胞。將持留菌分為兩組，離心并丟棄培養(yǎng)基。一組持留菌用4 倍MIC 聚合物處理，另一組用10 倍MIC 環(huán)丙沙星處理。兩組菌液每隔6 h 分別取樣，菌液用PBS 稀釋后涂布于LB 瓊脂平板上，培養(yǎng)過夜后計數(shù)。通過計算得到每次取樣時的菌濃C。

1.3.5 蛋白酶K 的濃度篩選 人工尿液的配制：將450 mL 去離子水加熱到45 ℃并保持恒溫，隨后依次加入0.85 g 磷酸氫二銨、0.25 g 氯化鎂、1.01 g 氯化鉀、1.01 g 硫酸鈉、0.38 g 尿素、0.75 g 肌酸和 0.12 g 氯化鈣，完全溶解后，用2 mol/L 稀鹽酸將溶液的pH 調(diào)到6.2，最后定容到500 mL。人工尿液通過0.22 μm 的聚醚砜濾頭過濾并在4 ℃儲存。人工尿液中成熟S. aureusUSA300 生物被膜的培養(yǎng)：菌濃度為5×108CFU/mL，以每孔100 μL 的體積加到細胞培養(yǎng)96 孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。

蛋白酶K 的濃度篩選：吸取人工尿液培養(yǎng)的S. aureusUSA300 成熟生物被膜的上清液，使用PBS 小心清洗一次以除去浮游菌。在另一塊96 孔板中，將蛋白酶K 用人工尿液以2 倍逐級稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度，最終溶液體積為110 μL。將稀釋好的蛋白酶K 溶液轉(zhuǎn)移到底部有成熟S. aureusUSA300 生物被膜的96 孔板中，最終每孔中蛋白酶K 溶液的體積為200 μL。以僅加入200 μL 人工尿液的生物被膜作為對照組。蛋白酶K與成熟生物被膜作用3 h 后，小心吸出每孔中的溶液，并每孔添加100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）溶于PBS 中。在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h 后，移除MTT，并向每孔中添加100 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解藍紫色的甲瓚結(jié)晶?？装逯糜趽u床上搖動20 min，確保甲瓚完全溶解。用酶標儀平板閱讀器在570 nm 處采集光密度（OD）值。生物被膜內(nèi)部的細菌細胞活力（CV）通過公式（1）計算得到。

1.3.6 破壞成熟生物被膜測試 MH 中成熟S. aureusUSA300 生物被膜的培養(yǎng)條件：菌濃度為105CFU/mL，以每孔100 μL 的體積加到細胞培養(yǎng)96 孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。聚合物與蛋白酶K 協(xié)同抗成熟生物被膜活性測試通過分步給藥進行。先將蛋白酶K 使用人工尿液稀釋到設(shè)定濃度，加入到含有成熟生物被膜的孔板中，每孔200 μL。蛋白酶K 分散生物被膜3 h 后，吸出孔板中的溶液，并以每孔200 μL 施加以人工尿液為溶劑稀釋的聚合物溶液，聚合物與生物被膜作用時間為24 h。以人工尿液處理27 h 為未處理對照組；蛋白酶K處理3 h 后人工尿液培養(yǎng)24 h 為僅蛋白酶K 對照組；人工尿液處理3 h 后聚合物處理24 h 為僅聚合物對照組。MTT 染色及細胞活力計算參照“1.3.5”節(jié)。

1.3.7 成熟生物被膜的活/死染色 生物被膜在用蛋白酶K 和聚合物處理后，將孔中的介質(zhì)丟棄，用PBS 小心清洗生物被膜，去除浮游菌?；?死染料由12 μmol/L SYTO 9 和60 μmol/L PI 按物質(zhì)的量之比為1：8 配制而成。每孔加入50 μL 活/死染料，對生物被膜內(nèi)的細菌進行染色。5 min 后去除染料。經(jīng)PBS 清洗后，于熒光顯微鏡下拍攝生物被膜的熒光圖像。

1.3.8 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey檢驗進行統(tǒng)計分析。當P≤0.05 時，認為平均值具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽聚合物的合成與表征

聚合物的GPC 曲線如圖3（a）所示。P（DLL-co-BLG）的分子量呈現(xiàn)窄分布，?=1.17。根據(jù)得到的Mn計算出聚合度（DP）為27。脫保護并純化后的聚合物經(jīng)過核磁表征（圖3（b）），證明了聚合物的成功合成。

圖3 P（DLL-co-BLG）的（a）GPC 曲線和（b）1H-NMR 圖譜Fig. 3 （a）GPC curve and （b）1H-NMR spectrum of P（DLL-co-BLG）

2.2 多肽聚合物的殺菌活性

對金黃色葡萄球菌的MIC 測試表明，無論是對于標準菌株還是臨床菌株，P（DLL-co-BLG）都展現(xiàn)了MIC 為12.5～25 μg/mL 的高殺菌活性（圖4（a））。通過涂布平板法得到P（DLL-co-BLG）對S. aureusUSA300的最低殺菌濃度為25 μg/mL（圖4（b））。

圖4 P（DLL-co-BLG）（a）對金黃色葡萄球菌的MIC 值和（b）對S. aureus USA300 的MBC 值Fig. 4 （a）MIC against S. aureus and （b）MBC against S. aureus USA300 of P（DLL-co-BLG）

2.3 多肽聚合物的殺菌機理

為了研究P（DLL-co-BLG）對MRSA 高殺菌活性的主要原因，使用細胞質(zhì)膜去極化法研究P（DLLco-BLG）與S. aureusUSA300 細胞質(zhì)膜之間的相互作用。作為陰性對照的萬古霉素由于不直接靶向細胞質(zhì)膜，因此沒有觀察到細胞質(zhì)膜去極化現(xiàn)象。與之形成鮮明對比的是，各個濃度的P（DLL-co-BLG）與細菌孵育后，均表現(xiàn)出DiSC3（5）熒光強度的迅速增強（圖5），引起的細胞質(zhì)膜去極化的程度與Triton X-100 相當。這一現(xiàn)象表明，P（DLL-co-BLG）對S.aureusUSA300 的質(zhì)膜穩(wěn)定性有非常強烈的干擾，證明了P（DLL-co-BLG）的殺菌機理為通過破壞細胞膜的完整性導(dǎo)致細菌死亡。

圖5 P（DLL-co-BLG）與S. aureus USA300 作用后DiSC3（5）熒光強度隨時間的變化Fig. 5 Fluorescence of DiSC3（5） in the presence of S. aureus USA300 and P（DLL-co-BLG） as a function of the incubation time

2.4 多肽聚合物消滅持留菌

MRSA 的持留菌常出現(xiàn)在生物被膜內(nèi)部，并且對抗生素高度耐藥，造成生物被膜的不完全清除，在長期治療期間易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。圖6 顯示，對于S. aureusUSA300 持留菌，4 倍MIC 的P（DLL-co-BLG）能在6 h 內(nèi)有效殺滅S. aureusUSA300 持留菌（活細胞數(shù)量減少約3 個對數(shù)單位），在18 h 內(nèi)P（DLL-co-BLG）完全消滅了S. aureusUSA300 持留菌（活細胞數(shù)量減少大于5 個對數(shù)單位）。相比之下，即使是10 倍MIC 的環(huán)丙沙星在30 h 內(nèi)都無法有效殺滅S. aureusUSA300 持留菌。P（DLL-co-BLG）對持留菌的高效殺滅活性為其進一步清除生物被膜奠定了基礎(chǔ)。

圖6 濃度為4×MIC 的P（DLL-co-BLG）對S. aureus USA300持留菌的殺菌動力學曲線Fig. 6 Time-kill curves for P（DLL-co-BLG） with final concentrations of 4×MIC against S. aureus USA300 persister cells

2.5 多肽聚合物聯(lián)合蛋白酶K 清除生物被膜

2.5.1 蛋白酶K 分散生物被膜濃度的篩選 使用生物被膜的內(nèi)部細菌活力評價蛋白酶K 對成熟生物被膜的分散能力結(jié)果見圖7（a），與未經(jīng)處理的對照組相比，經(jīng)40～0.02 U/mL 的蛋白酶K 處理后，S. aureusUSA300 生物被膜內(nèi)部的細菌活力最多可以降至對照組的60%以下，表明蛋白酶K 能有效破壞生物被膜的EPS，且在高鹽和尿素環(huán)境中穩(wěn)定。在保證酶的用量在實際應(yīng)用中可接受的情況下，選取1.25 U/mL 為蛋白酶K 分散成熟S. aureusUSA300 生物被膜的最佳使用濃度。

2.5.2 多肽聚合物與蛋白酶K 協(xié)同抗生物被膜 人工尿液介質(zhì)中成熟MRSA 生物被膜，經(jīng)16×MIC 到1×MIC的P（DLL-co-BLG）處理后，生物被膜內(nèi)部細菌都一定程度被殺滅（圖7（b））。與未經(jīng)處理的S. aureusUSA300 生物被膜相比，1.25 U/mL 蛋白酶K 處理的生物被膜內(nèi)部細菌活力為對照組的55%左右。蛋白酶K和1×MIC 及以上濃度的P（DLL-co-BLG）聯(lián)合處理后，生物被膜內(nèi)部細菌活力均降低。P（DLL-co-BLG）濃度在8×MIC 及以上時，這種聯(lián)合作用可以使生物被膜內(nèi)部的細菌量降低到對照組的20%以下（圖7（c））。圖8為生物被膜的活/死染色圖像，對照組的成熟生物被膜呈現(xiàn)致密的綠色熒光。由于生物被膜在拍攝之前經(jīng)過PBS 清洗，大量死細菌因與孔板的黏附力弱而脫離孔板，因此蛋白酶K 和P（DLL-co-BLG）協(xié)同作用后的生物被膜細菌殘留較少，并且僅能觀察到極少量的活細菌（綠色熒光）和極少量死細菌（紅色熒光）。證明了蛋白酶K 和P（DLL-co-BLG）協(xié)同作用在清除人工尿液中的成熟MRSA 生物被膜方面的潛力。

圖7 （a）不同濃度的蛋白酶K 對人工尿中S. aureus USA300 成熟生物膜細菌活力的影響；（b）MTT 法獲得人工尿中P（DLL-co-BLG）對S. aureus USA300 成熟生物被膜的清除活性（*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001，顯著性差異是通過與未經(jīng)聚合物處理的對照組對比得到的）；（c）人工尿液介質(zhì)中，蛋白酶K 和P（DLL-co-BLG）聯(lián)合作用后，S. aureus USA300 成熟生物被膜內(nèi)部的細菌活力（圖中小寫字母表示各實驗組間有顯著性差異（P＜0.05）柱狀圖上方為藥物處理和未處理的經(jīng)過MTT 染色后的生物被膜的圖像）Fig. 7 （a） Effects of proteinase K on mature S. aureus USA300 biofilms in artificial urine; （b） Eradication activity of P（DLL-co-BLG）in artificial urine against mature S. aureus USA300 biofilms obtained by MTT assay （*P ＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,significant difference analysis results were obtained when compared with the control groups that had not been treated with polymers）;（c） Remaining cell viability within mature S. aureus USA300 biofilm after the combined action of proteinase K and P（DLL-co-BLG） in artificial urine （Different lowercase letters indicate significant difference （P＜ 0.05） between different experimental groups, above the bar diagram are the corresponding images of treated and untreated biofilms after MTT staining and precipitation dissolution）

圖8 蛋白酶K 和P（DLL-co-BLG）聯(lián)合作用后，S. aureus USA300 成熟生物被膜的活/死染色圖像Fig. 8 Live-dead staining fluorescence micrographs of mature S. aureus USA300 biofilms treated with the combination of proteinase K and P（DLL-co-BLG）

3 結(jié) 論

（1）LiHMDS 引發(fā)的快速NCA 聚合方法合成的多肽聚合物P（DLL-co-BLG）對MRSA 及其持留菌的殺菌活性較高，采取膜破壞抗菌機制。

（2）P（DLL-co-BLG）在人工尿液環(huán)境中展現(xiàn)了抗生物被膜活性。與蛋白酶K 的協(xié)同作用增強了P（DLLco-BLG）在模擬導(dǎo)尿管生物被膜環(huán)境中對MRSA 成熟生物被膜的清除活性。