曾貝迪， 陳 濤,2,3， 趙黎明

（華東理工大學(xué)1.材料科學(xué)與工程學(xué)院, 上海市先進(jìn)聚合物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 中國(guó)輕工業(yè)生物材料工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3. 恒天生物基材料聯(lián)合研究院；4. 生物工程學(xué)院, 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心, 上海 200237）

靜電紡絲技術(shù)是連續(xù)制備超細(xì)纖維的主要方法，但制備的纖維直徑一般在100 nm 以上。通 常，只有當(dāng)纖維直徑小于50 nm 時(shí)才會(huì)顯現(xiàn)納米效應(yīng)。納米蛛網(wǎng)纖維是靜電紡絲中形成的一種以常規(guī)電紡纖維為支架，并具有類似蜘蛛網(wǎng)或肥皂泡的多邊形網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的二維網(wǎng)狀纖維，網(wǎng)狀纖維平均直徑僅為5～50 nm，具有極高孔隙率、多尺度孔徑分布、顯著納米效應(yīng)等諸多特點(diǎn)[1]。目前已通過(guò)聚酰胺6、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚氨酯等合成聚合物，以及殼聚糖（CS）、卵磷脂等天然大分子制備了一系列納米蛛網(wǎng)纖維材料[2,3]。

聚丁內(nèi)酰胺(PBL)的單體丁內(nèi)酰胺可由生物質(zhì)發(fā)酵制備的谷氨酸合成，因而屬于生物基聚合物[4]。其生物降解性已在堆肥、活性污泥、海水甚至體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[5-11]。PBL 的熔點(diǎn)接近其分解溫度，熱穩(wěn)定性差，嚴(yán)重限制了其熱加工及商業(yè)化。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備PBL 纖維可促進(jìn)PBL 在包括生物醫(yī)用材料在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

CS 是目前被發(fā)現(xiàn)的唯一的天然陽(yáng)離子聚合物，具有出色的生物降解性、生物相容性、抗菌性能和細(xì)胞黏附性能[12]。由于CS 鏈上同種電荷的排斥作用，CS 混合液的靜電紡絲難以實(shí)現(xiàn)，通常需與其他聚合物共混才能實(shí)現(xiàn)靜電紡絲，從而廣泛用于各種制藥和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[13-15]。

目前用于紡制納米蛛網(wǎng)纖維材料的合成材料力學(xué)性能較好，但因來(lái)源于化石基原料且不可降解，主要用于制備濾材。由天然大分子制備的納米蛛網(wǎng)纖維材料盡管生物相容性較好，可用于制備組織工程支架，但又存在力學(xué)性能方面的缺陷。僅有的納米蛛網(wǎng)復(fù)合纖維膜均使用聚酰胺6 與CS、卵磷脂復(fù)配，破壞了降解性能。本文以合成PBL 和天然CS 為原料，通過(guò)共溶劑實(shí)現(xiàn)了PBL/CS 靜電紡絲，制備了生物基可降解納米蛛網(wǎng)復(fù)合纖維膜，探討了兩者比例和混合液濃度對(duì)紡絲混合液性質(zhì)、纖維形貌、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)以及形成納米蛛網(wǎng)能力的影響，考察了電紡納米蛛網(wǎng)纖維膜的細(xì)胞增殖性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與設(shè)備

PBL：黏均分子量Mη= 4.5×104，根據(jù)文獻(xiàn)[16,17]由丁內(nèi)酰胺（w=99%，恒天生物基材料工程技術(shù)（寧波）有限公司）經(jīng)開(kāi)環(huán)聚合自行制備；CS：Mη=3.0×103，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲酸（FA）：w=88%，上海泰坦科技有限公司；小鼠成?。–2C12）細(xì)胞：上海博湖生物科技有限公司；MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 測(cè)試與表征

高壓直流電源:東文高壓電源（天津）股份有限公司DW-P503-1 型；注射泵：保定申辰泵業(yè)有限公司SPLab01-E 型；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司S-4 800 型，纖維膜噴金處理后通過(guò)SEM 記錄纖維形態(tài)，在SEM 照片中分別選取50 根支架纖維和50 根納米蛛網(wǎng)纖維，用Image-pro Plus 5.0 圖像分析軟件計(jì)算兩種纖維的平均尺寸，并采用該軟件在SEM 照片中圈出存在納米蛛網(wǎng)纖維的區(qū)域，以其面積占整體圖片面積的百分比為蛛網(wǎng)覆蓋率；X 射線衍射(XRD)儀：日本理學(xué)電機(jī)D/max2550VB/PC 型，在室溫下采用Cu-Kα 輻射管（λ=0.154 nm），電流為40 mA，電壓為40 kV，掃描范圍為5°～55°；傅里葉紅外光譜（FT-IR）：美國(guó)熱電公司Nicolet 5 700 型，用溴化鉀壓片法制備測(cè)試樣品，測(cè)試范圍為4 000～400 cm-1；電導(dǎo)率儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司DDBJ-350 型，將電導(dǎo)率儀石墨電極浸入紡絲混合液至少30 mm 深，維持至少1 min，測(cè)量混合液電導(dǎo)率；旋轉(zhuǎn)流變儀：奧地利安東帕公司MCR 302 型，25 ℃下在錐板流變儀上測(cè)定混合液黏度，使用帶有環(huán)境箱的Peltier 平臺(tái)防止溶劑蒸發(fā)。

細(xì)胞親和性測(cè)試：將纖維膜超凈臺(tái)滅菌24 h 后，置于24 孔板內(nèi)加入培養(yǎng)基浸泡24 h。用移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞（1 mL），加一組空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d。用移液槍吸取浸泡纖維膜24h后的浸漬液加入96 孔板，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞（500 μL），置于37 °C 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d。每孔加入MTT 工作液100 μL，放入37 °C 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液，放入振蕩箱振蕩15 min 溶解結(jié)晶。每孔取100 μL 加入96 孔板放置于酶標(biāo)儀上，檢測(cè)其在570 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD 比值得到細(xì)胞存活率。

活/死細(xì)胞染色（Live/Dead）試劑盒測(cè)試：利用試劑盒對(duì)附著在纖維膜上的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。細(xì)胞試劑盒含有鈣黃素 AM 和碘化丙啶溶液，可分別染色活細(xì)胞和死細(xì)胞。其實(shí)驗(yàn)過(guò)程與細(xì)胞親和性測(cè)試相同，最后獲得37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d的實(shí)驗(yàn)測(cè)試樣品。將鈣黃素 AM 和碘化丙啶溶液加入到纖維膜表面后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡獲得細(xì)胞熒光照片。

1.3 PBL/CS 共混纖維膜的制備

將PBL 和CS 按照一定比例溶解在甲酸中，配制成混合液，超聲振蕩 30 min 充分溶解，再靜置30 min 脫除氣泡后進(jìn)行靜電紡絲。紡絲電壓25 kV，混合液流速1.0 mL/h，接收距離15 cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維膜形貌

固定PBL/CS 甲酸混合液中聚合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)（wp）為8.0 %，圖1 為該混合液中CS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（CS）=m（CS）∶m（CS+PBL）,下文同）對(duì)復(fù)合纖維膜形貌的影響。圖1（a～c）為PBL/CS 復(fù)合電紡膜的SEM照片，相應(yīng)的纖維直徑分布統(tǒng)計(jì)如圖1（a1～c1）所示?；旌弦旱碾妼?dǎo)率（σ）及黏度（η），以及電紡纖維膜的相關(guān)性質(zhì)列于表1。由圖可見(jiàn)，增加w（CS），纖維膜中纖維粗細(xì)不均勻，直徑分布在10 ～300 nm，且均非納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)。如表1 所示，當(dāng)w（CS）=0 時(shí)，由于甲酸對(duì)PBL 氫鍵作用破壞較強(qiáng)，混合液黏度較低，只有0.46 Pa·s，不足以使混合液在噴頭處形成穩(wěn)定的泰勒錐，且電導(dǎo)率相對(duì)較低，因而最終在靜電場(chǎng)力和重力的共同作用下，混合液滴落形成球形顆粒，得不到連續(xù)纖維。隨著PBL/CS 甲酸混合液中w（CS）的增加，接收板上可收集到不同粗細(xì)的纖維，纖維膜的孔隙率（P）隨之增加。當(dāng)w（CS）=10%時(shí)，纖維平均直徑（D）為 90 nm。當(dāng)w（CS）=20%時(shí)，纖維平均直徑減少至 72 nm。相較于w（CS）=10% 的情形，當(dāng)w（CS）=20% 時(shí)混合液的黏度由1.85 Pa·s 提高到4.77 Pa·s，且CS 分子鏈上質(zhì)子化氨基進(jìn)一步增加了混合液電荷密度，混合液的電導(dǎo)率由4.21 mS/cm 增加至5.14 mS/cm，在高電場(chǎng)中射流得以充分劈裂和拉伸，形成更細(xì)的纖維。當(dāng)w（CS）=30%時(shí)，纖維平均直徑增加至94 nm。此時(shí)，雖然混合液電導(dǎo)率和黏度均增加，但黏度的增幅更大，使纖維重新變粗。由表1 數(shù)據(jù)可知，增加w（CS）引起的混合液黏度增幅遠(yuǎn)大于電導(dǎo)率的增幅。一般而言，混合液黏度增加會(huì)使纖維變粗，而電導(dǎo)率的增加則使纖維變細(xì)。增加w（CS）對(duì)纖維平均直徑影響不大，表明混合液電導(dǎo)率小幅度增長(zhǎng)制約了黏度大幅度增長(zhǎng)帶來(lái)的直徑增粗效應(yīng)，亦即在PBL/CS 的甲酸混合液體系中，如要改變纖維直徑，大幅度改變電導(dǎo)率將比改變混合液黏度更為有效。

圖1 PBL/CS 纖維膜的形貌：（a～c）纖維膜的SEM 照片；（a1～c1）纖維的直徑分布圖Fig. 1 Morphology of PBL/CS composite fiber membranes: (a—c) SEM images of fiber membranes; (a1—c1) Diameter distribution of fiber

表1 w（CS）對(duì)混合液及纖維膜性質(zhì)的影響Table 1 Influence of w(CS) on the properties of solutions and fiber membranes

圖2（a～c）分別為不同wp條件下所得纖維膜的SEM 照片，對(duì)應(yīng)支架纖維的直徑分布圖如圖2（a1～c1）所示。圖2（b2，c2）分別為圖2（b，c）中蛛網(wǎng)纖維的直徑分布?；旌弦杭袄w維膜的性質(zhì)列于表2 中。如圖2（a）所示，當(dāng)w（CS）=10 %、wp=9.0 %時(shí)，纖維直徑分布均勻，存在少量串珠，纖維直徑約 61 nm，未出現(xiàn)納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)。如圖2（b）所示，當(dāng)wp=10.0 %，w（CS）=20 %時(shí)，纖維膜中串珠消失，出現(xiàn)少量納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)，支架纖維平均直徑為 140 nm，納米蛛網(wǎng)纖維平均直徑13 nm，蛛網(wǎng)覆蓋率僅約10%，同時(shí)蛛網(wǎng)纖維存在斷頭。如圖2（c）所示，當(dāng)wp=11.0 %、w（CS）=30%時(shí)，納米蛛網(wǎng)纖維斷頭消失，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)展充分并變得密集，部分區(qū)域黏連成薄膜，覆蓋率達(dá) 100%，支架纖維直徑繼續(xù)增加到 164 nm，納米蛛網(wǎng)纖維平均直徑減小到10 nm。

表2 不同混合液濃度對(duì)混合液及復(fù)合纖維膜性質(zhì)的影響Table 2 Effect of wp on the properties of solutions and fiber membranes

表3 為不同w（CS）下wp的變化對(duì)電導(dǎo)率及黏度增幅的影響。由表3 數(shù)據(jù)可知，增加wp引起的黏度增幅小于電導(dǎo)率的增幅。由前述分析可知，在PBL/CS 的甲酸混合液中，電導(dǎo)率對(duì)纖維直徑的影響更大，當(dāng)其增幅大于黏度的增幅時(shí)，可形成更多帶電射流和微小液滴，且這些微小液滴在電場(chǎng)中飛行時(shí)隨溶劑揮發(fā)發(fā)生相分離，形成的濃相在溶劑揮發(fā)后得到相互連接的納米蛛網(wǎng)纖維主體，而稀相則成為納米蛛網(wǎng)膜上的孔洞[18]。圖2（c）中白色箭頭指示的納米蛛網(wǎng)中部分黏連薄膜是由未完成相分離的微小液滴形成的。

表3 wp 對(duì)電導(dǎo)率及黏度增幅的影響Table 3 Effect of wp on the increase of solution conductivity and viscosity

圖2 PBL/CS 復(fù)合纖維膜的形貌：（a～c） PBL/CS 復(fù)合纖維膜的SEM 照片；（a1～c1）支架纖維的直徑分布；（b2，c2）（b，c）中蛛網(wǎng)纖維的直徑分布Fig. 2 Morphology of PBL/CS composite fiber membranes: （a—c） SEM images of samples; （a1—c1） Diameter distribution of samples;（b2—c2） Diameter distribution of nano-cobweb fibers in (b，c), respectively

2.2 纖維膜結(jié)構(gòu)

圖3 為PBL/CS 復(fù)合纖維膜樣品的紅外譜圖。譜圖中在3 300 cm-1處為N―H 的伸縮振動(dòng)峰，3 070 cm-1處為的偶合振動(dòng)峰，2 935 cm-1處為PBL 上―CH2―的伸縮振動(dòng)峰，2 860 cm-1處為―CH―的伸縮振動(dòng)峰，1 643 cm-1處為C=O 的伸縮振動(dòng)（酰胺I）峰，1 546 cm-1處為N―H 的彎曲振動(dòng)（酰胺II）峰，1 080 cm-1處特征峰歸屬于CS 的六元環(huán)。由圖可見(jiàn)，隨著w（CS）的增加，3 300 cm-1處的N―H 伸縮振動(dòng)峰強(qiáng)和1 546 cm-1處的N―H 彎曲振動(dòng)峰強(qiáng)明顯減弱，表明CS 破壞了PBL 分子鏈間的氫鍵相互作用，而在PBL 與CS 之間形成了新的氫鍵相互作用[19,20]。

圖3 PBL/CS 復(fù)合纖維膜的FT-IR 譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of PBL/CS composite fiber membranes

圖4 為復(fù)合纖維膜樣品的XRD 曲線。如前所述，在本文所使用的電紡條件下無(wú)法紡制純PBL 纖維，圖4（a）中純PBL 纖維在流速2.5 mL/h、電壓36 kV 條件下紡制。純PBL 纖維在2θ=20.6°，24.4°處出現(xiàn)了聚酰胺α-晶型特征峰，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道結(jié)果相同。PBL/CS 纖維膜中這兩個(gè)結(jié)晶峰峰強(qiáng)大大削弱，甚至消失。一方面可能是由于電紡過(guò)程中溶劑快速揮發(fā)，PBL 及CS 分子鏈來(lái)不及做規(guī)整堆砌，導(dǎo)致結(jié)晶度降低;另一方面，CS 鏈上的羥基、氨基及醚鍵會(huì)與PBL 鏈上的羰基和氨基形成新的氫鍵作用，從而抑制各自鏈段的有序排列，也會(huì)造成結(jié)晶度降低。

圖4 PBL/CS 復(fù)合纖維膜及PBL 粉末的XRD 譜圖Fig. 4 XRD patterns of PBL powder and PBL/CS composite fiber membranes

2.3 纖維膜的生物性能

圖5 為PBL/CS 纖維膜對(duì)C2C12 細(xì)胞活性影響的MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5（a）直接MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同wp復(fù)合纖維膜的細(xì)胞存活率均接近空白對(duì)照組，表明PBL/CS 復(fù)合纖維膜沒(méi)有細(xì)胞毒性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。圖5（b）間接MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)wp=11.0 %時(shí)，纖維膜浸漬液中細(xì)胞活力值為84 %，但仍屬于無(wú)毒性安全范圍。推測(cè)這是由于wp較高，制得的支架纖維較粗，纖維膜中存在少量未揮發(fā)掉的溶劑甲酸，浸漬過(guò)程中滲透進(jìn)浸漬液，從而對(duì)細(xì)胞造成一定毒害。

圖6 是種植細(xì)胞的PBL/CS 復(fù)合纖維膜的體外熒光照片。由圖可見(jiàn)，種植在纖維膜上的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未凋亡（凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)紅色）。納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)復(fù)合纖維膜上的細(xì)胞大多呈現(xiàn)紡錘型，而不是圓形，表明細(xì)胞較好地黏附在纖維上。這是由于具有納米構(gòu)建體的膜表面為蛋白質(zhì)的吸附提供了更大的表面積，存在更多與細(xì)胞膜受體的結(jié)合位點(diǎn)。上述結(jié)果表明，納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)的PBL/CS 復(fù)合纖維膜無(wú)細(xì)胞毒性，并具有良好的細(xì)胞親和性，可促進(jìn)細(xì)胞在其上的增殖。

3 結(jié) 論

（1）通過(guò)PBL/CS 甲酸混合液靜電紡絲制備了生物基可降解納米蛛網(wǎng)復(fù)合纖維膜。

（2）在PBL/CS 的甲酸混合液體系中，相比增加混合液黏度，在w（CS）不變時(shí)，提高wp可大幅提升混合液電導(dǎo)率，從而有利于制得納米蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)的復(fù)合纖維膜。

（3）PBL/CS 復(fù)合纖維膜中，纖維的結(jié)晶度低，屬于無(wú)定形狀態(tài)。

（4）PBL/CS 納米蛛網(wǎng)復(fù)合纖維膜可促進(jìn)細(xì)胞在其上的增殖，有望應(yīng)用于傷口敷料、組織工程支架等領(lǐng)域。