韓甜甜，尹 婕，曾 靖，金 瀅，李 艷，潘凌亞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 婦產(chǎn)科 國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心， 北京 100730)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中病死率最高的疾病[1]。盡管近幾年生物信息學(xué)、分子基因?qū)W等各領(lǐng)域研究飛速進(jìn)展，由此衍生了新型分子生物制劑，但是患者的復(fù)發(fā)率、生存率無明顯改善[2]。這主要由于卵巢癌的異質(zhì)性使得其在基因組學(xué)上表型復(fù)雜，難以統(tǒng)一其病因及發(fā)病機(jī)制之故[3]。

膜蛋白間的交聯(lián)黏附、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體在胞外微環(huán)境、胞內(nèi)調(diào)控等生物過程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移耐藥具有一定的關(guān)聯(lián)性[4]，一些有關(guān)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究已經(jīng)在多種腫瘤包括前列腺癌、腎癌、乳腺癌等方面取得了進(jìn)展[5]。本課題組驗(yàn)證了側(cè)群細(xì)胞具有卵巢癌干細(xì)胞樣生物學(xué)特性，并通過蛋白組學(xué)初步篩選出側(cè)群細(xì)胞中顯著上調(diào)的膜蛋白CDC50A[6]。CDC50A是由1 361個氨基酸組成的二級跨膜蛋白，較短的N端和C端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞外為較大的環(huán)形結(jié)構(gòu)[7]。它是維持細(xì)胞膜磷脂分子的正確折疊以及轉(zhuǎn)運(yùn)至最終的亞細(xì)胞位置的重要蛋白[8-9]。有研究資料表明在卵巢癌中，P4型磷脂轉(zhuǎn)移酶(type Ⅳ-P-type phospholipid transferases,P4-ATPases)與CDC50A形成膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，導(dǎo)致順鉑耐藥[9-10]，故CDC50A與卵巢癌存在著必然的相關(guān)性，可能是卵巢癌干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白。本研究建立了穩(wěn)定表達(dá)CDC50A的細(xì)胞株，為今后實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MEMα培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)；病毒包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG和pCMV-Δ8.9、健康人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T、大腸桿菌菌株DH5α/TOP10、質(zhì)粒pLVX-IRES-GFP(原清華大學(xué)癌癥與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室郭偉教授贈予)；克隆載體(EZ-TTMCloning Vector)、T載體快速鏈接試劑盒(北京康潤誠業(yè)生物科技公司)；EcoRⅠ、NotⅠ酶(MBI公司)； PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTPs(TaKaRa公司)；T4DNA連接酶(Promega公司)；DNA轉(zhuǎn)染介質(zhì)(PolyJetTMSignaGen公司)；病毒濃縮液(上海依科賽生物制品有限公司)；Polybrene聚凝胺、CHAPS(翌圣生物公司)；Immobilon-P膜(Merck公司)；兔抗Flag-tag多克隆抗體(華興博創(chuàng)公司)；ECL化學(xué)發(fā)光底物(Thermo公司)；Alexa Fluor? 647 熒光素標(biāo)記的兔抗人二抗、鼠抗β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；DAPI的熒光防淬滅封片劑(上海浩然生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK-293T細(xì)胞系以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2CDC50A克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)HUGO基因命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)發(fā)表的CDC50A(GENE ID：55754)轉(zhuǎn)錄變體1的序列設(shè)計(jì)引物(F：5′-GCGG AATTCGCCACCATGGCGATGAACTATAAC-3′；R:5′-GCCGCGGCCGCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAA TCTCCTCCTCCAATGGTAATGTCAGCTG-3′)，提取HEK-293T細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，通過PCR擴(kuò)增CDC50A全長，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；92 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，75 ℃延伸45 s，35個循環(huán)后72℃延伸3 min。然后將產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DNA回收試劑盒從凝膠中回收目的片段。

將回收的基因片段與克隆載體相連接形成重組質(zhì)粒，通過酶切鑒定，利用通用引物(CMV-F、IRES-R)進(jìn)行測序，經(jīng)測序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒與表達(dá)載體pLVX-IRES-GFP分別進(jìn)行雙酶切，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10中，擴(kuò)增后提取單克隆質(zhì)粒，再次進(jìn)行酶切鑒定，完成表達(dá)質(zhì)粒pLVX-CDC50A-GFP的構(gòu)建。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將1 μg表達(dá)質(zhì)粒pLVX-CDC50A-GFP、3 μL DNA轉(zhuǎn)染試劑與100 μL的DMEM培養(yǎng)液預(yù)混配置瞬時轉(zhuǎn)染復(fù)合體，然后輕柔加入含HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中。同法配置并轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pLVX-IRES-GFP作為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為空白對照組。48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 慢病毒包裝：以1∶1∶2的比例將病毒包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG、pCMV-Δ8.9分別與擬整合的質(zhì)粒pLVX-CDC50A-GFP或其空白對照質(zhì)粒pLVX-IRES-GFP混合在DMEM中，通過DNA轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物溶液，輕柔放入含HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中，60 h后經(jīng)低溫離心收集病毒液。最后通過病毒濃縮液處理、PBS重懸后得到病毒原液。

測算病毒滴度：預(yù)先在6孔板中培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞，稀釋病毒原液至10倍，利用Polybrene聚凝胺將慢病毒感染至細(xì)胞中。72 h后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析陽性細(xì)胞比例，計(jì)算病毒滴度(TU/mL)=細(xì)胞數(shù)目×感染細(xì)胞陽性率×稀釋比例。

1.2.5 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立：將重組表達(dá)載體pLVX-CDC50A-GFP、空載體pLVX-IRES-GFP的病毒原液分別與MEMα培養(yǎng)液、Polybrene聚凝胺混勻配制感染復(fù)合體，分別均勻放入SKOV3細(xì)胞系培養(yǎng)基中。待病毒感染72 h后，在熒光顯微鏡下，觀察綠色熒光激發(fā)比例。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選帶有綠色免疫熒光的陽性細(xì)胞后，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染病毒的SKOV3細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.2.6 免疫印跡：用CHAPS裂解膜蛋白，經(jīng)低溫離心收集上清液，BCA法定量，用金屬浴將蛋白質(zhì)變性。將蛋白質(zhì)樣品在標(biāo)準(zhǔn)條件下通過SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜。以鼠抗人單克隆actin抗體(1∶5 000)加入抗體緩沖液(PBS含0.01% Tween20和0.1% BSA)作為內(nèi)參，檢測樣品中兔抗Flag-tag多克隆抗體(1∶5 000)，使用ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測信號。

1.2.7 免疫熒光：預(yù)先將SKOV3細(xì)胞株鋪在盛有蓋玻片的6孔板上。用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100溶液滲透細(xì)胞，5%羊血清PBS封閉以阻斷抗體的非特異性結(jié)合。用兔抗Flag-tag多克隆抗體(1∶200)在4 ℃條件下孵育，最后用Alexa Fluor?647 熒光素標(biāo)記的兔抗人二抗(1∶500)標(biāo)記一抗。標(biāo)記完成后，去除二抗，用熒光防淬滅封片劑封片。使用Zeiss LSM880超高分辨倒置共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.2.8 流式細(xì)胞學(xué)檢測：用含有1%胎牛血清的PBS制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/100 μL。以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對照組。以最大吸光波長488 nm、最大反射波長525 nm檢測綠色熒光細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 鑒定表達(dá)質(zhì)粒pLVX-CDC50A-GFP

克隆表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后，可見與預(yù)期條帶大小相符的單一條帶(圖1)。

2.2 pLVX-CDC50A-GFP質(zhì)粒的蛋白表達(dá)

空載體對照組轉(zhuǎn)染率為78.9%，重組CDC50A表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為50.8%(圖2)。免疫印跡結(jié)果顯示重組質(zhì)?？蓽y得標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，而空白對照組、陰性對照組則無表達(dá)(圖3)。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)CDC50A的SKOV3細(xì)胞株檢測及表達(dá)鑒定

利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測綠色熒光細(xì)胞比例，空載體組為94.9%，CDC50A穩(wěn)定表達(dá)組為86.5%(圖4)。通過免疫印跡技術(shù)定量檢測到在50 ku處單一條帶，而空白對照組中無條帶顯示。進(jìn)一步通過免疫熒光技術(shù)分析可見CDC50A主要分布定位于細(xì)胞膜(圖5)。

圖1 pLVX-CDC50A-GFP表達(dá)質(zhì)粒及酶切鑒定Fig 1 Expression and identification of pLVX-CDC50A-GFP plasmid

A.fluorescence microscopy(scale bar=50 μm); B.flow cytometry scatter plot圖2 顯微鏡及流式細(xì)胞測量術(shù)檢測表達(dá)質(zhì)粒對HEK-293T細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染率Fig 2 Transient transfection rate of HEK-293T cells detected by microscopy and flow cytometry

圖3 pLVX-CDC50A-GFP質(zhì)粒中Flag標(biāo)簽蛋白特異性表達(dá)Fig 3 Specific expression of Flag-tag proteins of pLVX- CDC50A-GFP

3 討論

CDC50A蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)具有疏水性，可溶性差，這對克隆后定性移位至細(xì)胞靶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了負(fù)面影響[11]。故完成克隆并通過表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)CDC50A在細(xì)胞膜上高表達(dá)是后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本文通過分子克隆技術(shù)獲取了CDC50A表達(dá)載體，并成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的SKOV3細(xì)胞株，經(jīng)過定性、定量、定位檢測，證實(shí)獲得的CDC50A蛋白表達(dá)穩(wěn)定、特異。因此，此細(xì)胞株可作為研究CDC50A在SKOV3中作用的重要工具，為深入研究其與卵巢癌的相關(guān)性提供重要手段。

近年來，日本Tanaka實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了一系列關(guān)于CDC50家族參與磷脂內(nèi)翻酶的功能研究，發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中，CDC50家族蛋白定位在反面高爾基體上，發(fā)揮胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用，當(dāng)高爾基體膜泡生成障礙，囊泡堆積在反面高爾基上，功能蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致質(zhì)膜部分磷脂酰絲氨酸外翻，影響脂質(zhì)雙分子層的流動性，最終導(dǎo)致細(xì)胞出芽生殖受阻[12]。除了維持生理上的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，研究還發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞系中，CDC50A的表達(dá)下調(diào)，使得胞質(zhì)-胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體形成受阻，從而抑制了細(xì)胞對哌立福新的攝取[13]。目前尚無CDC50A在卵巢癌中作用的研究報(bào)道。有研究表明CDC50家族蛋白在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、參與胞吞胞吐等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、完成信號交換等方面起到重要的生物學(xué)作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)SKOV3過表達(dá)CDC50A后，CDC50A蛋白集中分布在細(xì)胞膜上，進(jìn)一步說明該膜蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分布靶向性，可能會影響細(xì)胞交聯(lián)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等重要的信號傳導(dǎo)途徑。因此，后續(xù)將在過表達(dá)CDC50A的SKOV3細(xì)胞株中，深入研究其發(fā)生發(fā)展及耐藥作用。

A.fluorescence microscopy(scale bar=50 μm); B.flow cytometry scatter plot圖4 SKOV3細(xì)胞株慢病毒載體感染率Fig 4 Infection efficiency of SKOV3 cell strain with lentiviral vector

A.the single band in pLVX-CDC50A-GFP group compared with no finding in blank and negative groups by Western blot; B.blue nucleus, yellow cytomembrane located by immunofluorescence(scale bar=20 μm)

本實(shí)驗(yàn)主要局限性在于僅建立了一個細(xì)胞株，但作為前期實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)完成了分子克隆及慢病毒包裝，并證明其可在多種卵巢癌細(xì)胞系完成病毒載體感染，在原代細(xì)胞中完成懸浮感染。