沙務(wù)嘎，李 雋

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 北京 100005)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的輔助調(diào)節(jié)因子，它是多種氧化還原反應(yīng)的輔酶，也是許多NAD+依賴酶的底物[1]。煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1 (nicotinamide single nucleotide adenosine transferase 1, NMNAT1)是催化NAD+生物合成的關(guān)鍵酶，它將煙酰胺單核苷酸 (nicotinamide mononucleotide, NMN)轉(zhuǎn)化生成NAD+，參與NAD+依賴的多種代謝過(guò)程，對(duì)維持生物體內(nèi)NAD+水平的穩(wěn)態(tài)十分重要。NMNAT1除參與NAD+生物合成外，還可以延緩神經(jīng)元軸突變性，與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[2]。NMNAT1介導(dǎo)的NAD+代謝在急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展中也起著重要調(diào)控作用，影響癌細(xì)胞的增殖和相關(guān)代謝活動(dòng)[3]；抑制NMNAT1使骨肉瘤細(xì)胞對(duì)放線菌素D的治療更敏感，為骨肉瘤治療提供了新思路[4]；肺腫瘤細(xì)胞系中NMNAT1的低表達(dá)水平與腫瘤對(duì)DNA損傷的敏感性增加相關(guān)，敲除NMNAT1可增強(qiáng)核糖體RNA轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)細(xì)胞死亡[5]?；贜MNAT1與腫瘤的密切關(guān)系，篩選以NMNAT1為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物將具有重要意義。

本研究利用人重組質(zhì)粒pET21b-NMNAT1在BL21 (DE3)大腸桿菌體系誘導(dǎo)表達(dá)人源NMNAT1蛋白，并鑒定了純化的重組NMNAT1酶純度，設(shè)計(jì)3步耦合酶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定它的酶活性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)包含2 280種天然化合物的文庫(kù)進(jìn)行篩選，成功篩選出了6種高效的NMNAT1抑制劑，其中一種抑制劑Fraxetin能有效降低乳腺癌細(xì)胞的NAD+含量，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，揭示了NMNAT1抑制劑治療腫瘤的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞: 人胚腎細(xì)胞系293T，人乳腺癌細(xì)胞系HCC70、MDA-MB-231[中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù))]。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(Corning公司)；人NMNAT1 cDNA (OriGene公司)；pET21b質(zhì)粒(Addgene公司)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4 DNA連接酶(NEB公司)；BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)；Ni-NTA Beads(GE Healthcare公司)；天然化合物庫(kù)(MCE公司)；Fraxetin(麥克林生化科技有限公司)；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside，IPTG)、β-煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotina-mide adenine dinucleotide，NAD+)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、Diaphorase、Resazurin(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 凝膠電泳檢測(cè)NMNAT1蛋白表達(dá)：將pET21b-NMNAT1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，加入含甘油的LB培養(yǎng)基保存于-80 ℃作為菌種，挑取菌種活化，IPTG誘導(dǎo)，凝膠電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 NMNAT1蛋白的純化：將蛋白上清液用0.22 μm膜過(guò)濾，將Ni-NTA Beads裝入填料柱，參照參考文獻(xiàn)[7]純化蛋白，收集各組分，進(jìn)行蛋白電泳分析。

1.2.3 重組NMNAT1蛋白酶活力的測(cè)定：3段式酶聯(lián)熒光法主要原理為第一步NMN在ATP存在下，由NMNAT1 轉(zhuǎn)化生成NAD+，第二步由ADH將NAD+轉(zhuǎn)化為NADH，第三步再通過(guò)Diaphorase傳遞NADH的電子使Resazurin轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，并發(fā)出熒光，設(shè)置不同濃度的NAD+標(biāo)準(zhǔn)品，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得對(duì)應(yīng)NAD+濃度，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.4 高通量篩選NMNAT1的抑制劑：取0.5 μL化合物加至96孔板中，終濃度為100 μmol/L，對(duì)照組不加入任何化合物，之后加入除NMNAT1重組酶以外的反應(yīng)液45 μL，最后加入純化的NMNAT1重組酶5 μL；37 ℃反應(yīng)30 min后95 ℃ 15 s終止反應(yīng)，按照1.2.3的步驟測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 細(xì)胞的基因敲低及加藥處理：利用shRNA靶向敲低NMNAT1，構(gòu)建293T對(duì)照細(xì)胞株和NMNAT1敲低細(xì)胞株(shNMNAT1)。將終濃度為50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的Fraxetin添加至乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液，24 h后收集細(xì)胞沉淀。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平：用 Triton 裂解液在冰上裂解細(xì)胞沉淀 30 min 后，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，蛋白定量后95 ℃變性5 min，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)入硝化纖維素膜。膜用5%的脫脂牛奶封閉，然后孵育一抗，用TBST緩沖液清洗3次，孵育二抗，用TBST緩沖液清洗3次。最后將膜與ECL發(fā)光液孵育并進(jìn)行曝光。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)NAD+含量的測(cè)定：細(xì)胞用Triton裂解液處理，充分裂解，液氮凍融3次，置冰上30 min后4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度；取300 μL上清用10 ku超濾管過(guò)濾，4 ℃，8 000 r/min，離心30 min，取100 μL過(guò)濾出上清，加入1%的NaOH(1 mol/L)，60 ℃，30 min，去除所有NAD+，僅剩余NADH，再加入10% Tris-HCl(0.5 mol/L pH=6.8)中合pH;另取30 μL過(guò)濾出的上清，用PBS稀釋4倍，作為NAD+和NADH的總和，減去NADH即為測(cè)得的NAD+，并除以蛋白濃度得到細(xì)胞內(nèi)NAD+含量。

1.2.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：將對(duì)照組及敲低NMNAT1的293T細(xì)胞，用無(wú)RNase的DPBS清洗后，加入1 mL Trizol試劑，提取RNA。將提取的RNA送至北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sequencing, RNA-seq)，得到基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NMNAT1 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

可檢測(cè)到在相對(duì)分子質(zhì)量約32 ku處有目的蛋白表達(dá)(圖1A)，且純度較高(圖1B)。

2.2 NMNAT1 蛋白的酶活力測(cè)定

檢測(cè)NMNAT1重組蛋白酶活性的原理如圖1C所示。由米氏方程測(cè)得重組NMNAT1酶的Vmax為1.034 μmol/(L·min)，米氏常數(shù)為11.91 μmol/L(圖1D)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)與NAD+濃度成正比關(guān)系(圖1D)。

2.3 NMNAT1抑制劑的篩選

使用購(gòu)自MCE公司的天然化合物庫(kù)(Cat.No.: HY-L021)搭建了高效酶聯(lián)反應(yīng)篩選平臺(tái)，鑒定這些化合物對(duì)NMNAT1活性的影響(圖2A)，篩選得出其中共有37種化合物表現(xiàn)出對(duì)NMNAT1活性的抑制作用(抑制效率>90%)，這其中又以6種化合物的抑制作用最為強(qiáng)烈(抑制效率>99%)，改變抑制劑的濃度，得到6種化合物的抑制曲線(圖2B)，并計(jì)算其IC50(表1)。

A.over expression of NMNAT1 in E.coli; B.purification of NMNAT1 using Ni-NTA; C.schematic diagram of NMNAT1 activity essay; D.verification of NMNAT1 activity essay: kinetic curve of NMNAT1 activity assay (left) and standard curve of NAD+(right)

A.screening results of natural compounds library; B.concentration response curve of 6 potent inhibitors candidates on NMNAT1 activity

表1 6種強(qiáng)效抑制劑的結(jié)構(gòu)與IC50Table 1 The structures and IC50 of 6 potent inhibitors candidates

2.4 敲低NMNAT1后差異基因的表達(dá)

為了確定抑制NMNAT1對(duì)細(xì)胞基本功能的影響，利用shRNA敲低293T細(xì)胞NMNAT1(圖3A)，對(duì)其進(jìn)行RNA-seq分析，篩選出shcont和shNMNAT1兩組之間的差異表達(dá)基因(圖3B)，其中表達(dá)上調(diào)的基因有741個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有643個(gè)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，上調(diào)的基因主要富集在p53類介導(dǎo)的DNA損傷內(nèi)在凋亡信號(hào)通路、DNA修復(fù)、組蛋白甲基化以及miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制通路(圖3C)；下調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞增殖、線粒體電子傳遞(NADH到泛醌)以及MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)等通路，其中電子從NADH到泛醌的傳遞減少，會(huì)直接造成線粒體呼吸鏈下游NAD+的減少(圖3D)。6種NMNAT1候選抑制劑中，fraxetin(7,8-二羥基-6-甲氧基-2-苯并吡喃酮)又名白蠟樹(shù)內(nèi)酯、秦皮素，已被證明具有促凋亡的作用[9]，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析方向一致，因此被選作NMNAT1抑制劑候選化合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 Fraxetin降低乳腺癌細(xì)胞NAD+含量并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

選取乳腺癌細(xì)胞研究fraxetin對(duì)腫瘤的殺傷機(jī)制，結(jié)果顯示fraxetin降低了乳腺癌細(xì)胞NAD+含量(圖4A)，Western blot結(jié)果顯示fraxetin促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞凋亡，具體表現(xiàn)在凋亡標(biāo)志物p53增多，抗凋亡因子Bcl-2減少(圖4B～C)。

A.NMNAT1- knockdown in 293T cells; B.volcano plots; GO enrichment analysis of up (C) and down (D) regulated differentially expressed genes after NMNAT1 knock-down

A.fraxetin reduced NAD+ level of HCC70 cells (left) and MDA-MB-231 cells (right) after treatment for 24 hours; fraxetin increased protein level of p53 while reduced Bcl-2 proteins in HCC70 cells (B)and MDA-MB-231 cells (C); *P<0.05 compared with control group

3 討論

NAD+是生物體進(jìn)行基本生物過(guò)程所必需的物質(zhì)，對(duì)于增殖和代謝活躍的腫瘤細(xì)胞，需要更多的NAD+來(lái)維持生命活動(dòng)，因此選擇性降低NAD+水平可以作為腫瘤治療的一種策略[10]。鑒于NMNAT1在NAD+生物合成中的重要作用，其在這一策略中將是重點(diǎn)研究目標(biāo)。NMNAT1的核心結(jié)構(gòu)為典型的二核苷酸結(jié)合域，其抑制劑可以占據(jù)催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的底物結(jié)合位點(diǎn)，起到抑制酶活性的作用[11]。單寧酸 (gallotannin) 是目前已報(bào)道的強(qiáng)效NMNAT1抑制劑，由1分子的葡萄糖與8～9個(gè)沒(méi)食子酸結(jié)合而成，含有大量苯酚羥基，能以疏水鍵和多點(diǎn)氫鍵與蛋白質(zhì)反應(yīng)，繼而影響蛋白活性，篩選出的NMNAT1抑制劑也都含有酚羥基，這可能是其發(fā)揮抑制作用的潛在機(jī)制；富含單寧酸的五倍子提取物可以抑制MAPK、NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯[12]，然而單寧酸的脂溶性差、生物利用度低、半衰期短，使它的臨床應(yīng)用受到限制[13]。Fraxetin是從白蠟樹(shù)皮中提取出的天然化合物，可以作為中藥使用，安全副作用低，具有抗腫瘤、抗氧化和抗感染作用[9, 14]；已有研究表明其以劑量依賴性方式抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，還誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞形態(tài)收縮和染色質(zhì)異常凝集，顯露了fraxetin對(duì)乳腺癌的潛在治療作用[15]。此次篩選發(fā)現(xiàn)它是NMNAT1的抑制劑，能降低乳腺癌細(xì)胞的NAD+含量，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本項(xiàng)研究的結(jié)果顯示fraxetin有望成為治療乳腺癌的新作用靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究建立了一種基于酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)NMNAT1酶活力的平臺(tái)，并成功篩選出了6種潛在的NMNAT1抑制劑，其中fraxetin作為NMNAT1強(qiáng)效抑制劑，能降低乳腺癌細(xì)胞NAD+含量并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析揭示了敲低NMNAT1造成細(xì)胞凋亡通路上調(diào)，細(xì)胞增殖通路下調(diào)，提示抑制NMNAT1可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制癌細(xì)胞的增殖，為NMNAT1抑制劑在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論支持。