史冬雪，原佳琪，丁寶鋒，王小爽，余 佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種由非酒精因素導(dǎo)致的以肝臟細(xì)胞脂肪變性為主要特征的代謝綜合征，與較高的脂肪攝入量以及肥胖狀態(tài)相關(guān)聯(lián)[1]。 NAFLD包括單純的肝臟脂肪變性(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)以及肝纖維化等多個疾病階段[2]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，NAFLD的發(fā)病率逐年升高，在全球有超過25%的成年患者群體[3]。由于有著非常復(fù)雜的發(fā)病機制，人類對NAFLD的治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。NAFLD小鼠模型的建立在研究NAFLD的發(fā)病機制、尋找潛在診療靶點方面發(fā)揮了非常重要的作用。

原代肝細(xì)胞是多種生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)工具細(xì)胞，獲得高活力且高產(chǎn)量的原代小鼠肝細(xì)胞在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。目前，獲取小鼠原代肝細(xì)胞主要基于經(jīng)典的兩步膠原酶灌注技術(shù)及其改進方案來實行[4-6]，實驗中先用無鈣離子的緩沖液灌注肝臟，除去肝臟中的鈣離子，打破細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接作用，再用含鈣的膠原酶溶液進一步消化，能夠獲得較高質(zhì)量的原代肝細(xì)胞。但是當(dāng)肝臟發(fā)生脂肪變性時，肝細(xì)胞變得脆弱，使用傳統(tǒng)的分離方法難以獲得高質(zhì)量原代細(xì)胞，且在NAFLD小鼠中獲取原代肝細(xì)胞的技術(shù)仍然少有報道。本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，通過精準(zhǔn)控制溫度、降低膠原酶濃度、使用低速離心和低速密度梯度離心等優(yōu)化，使NAFLD小鼠中肝細(xì)胞活性和產(chǎn)量得到提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料: 用于建模的C57BL/6J雄性小鼠(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)60只，飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所動物實驗室；普通飼料(xt013，協(xié)同生物公司)；高脂飼料(D12492，Research Diets公司)。

1.1.2 主要試劑：DNase Ⅰ(10104159001，Roche公司)；Ⅳ型膠原酶、EGTA、D-(+)-葡萄糖(C5138、E4378、G8270， Sigma公司)；分離液 Percoll(17089102，GE公司)；10×D-Hank’s緩沖液、氯化鈣溶液、天狼猩紅染色試劑(H1046、G0070、S8060, 索萊寶公司)；煤油(K118401, 阿拉丁公司)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(391338, Merck公司)；RPMI 1640(011001, BI公司)；4%多聚甲醛(P4500, Lablead公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(10100147，Gibco公司)；0.4%錐蟲藍(lán)染色劑(T10282，Invitrogen公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S，碧云天公司)。

1.1.3 溶液配方：緩沖液 Ⅰ (Hank’s緩沖液, 5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2 mmol/L EDTA(EGTA), 0.1% 葡萄糖, pH 7.4);緩沖液Ⅱ(Hank’s緩沖液, 5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5 mmol/L CaCl2, 0.1% 葡萄糖, 0.4 mg/mL Ⅳ型膠原酶, pH 7.4);緩沖液 Ⅲ(RPMI 1640, 2 mmol/L CaCl2, 10% FBS, 1% DNase Ⅰ)。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD小鼠模型的建立：將60只7周齡的小鼠平均分成兩組：一組飼喂正常飼料(chow diet, CD)，作為對照組，另一組飼喂高脂飼料(high-fat diet, HFD)，作為實驗組。

1.2.2 肝臟組織形態(tài)學(xué)的檢測：取1 cm×1 cm×0.5 cm的小鼠肝臟組織，使用10倍體積的4%多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋，取5 μm的切片進行HE染色和天狼猩紅染色，評估其形態(tài)學(xué)的改變。

1.2.3 NAFLD小鼠肝臟細(xì)胞的獲?。?)緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ在42 ℃水浴中預(yù)熱，緩沖液 Ⅲ在冰上預(yù)冷。

2)麻醉小鼠：①制作30%異氟烷混合液[異氟烷∶煤油=3∶7(v/v)]。②在500 mL透明小室中，放入1 mL異氟烷混合液潤濕的紗布，小鼠在小室中麻醉1～2 min，待其翻正反射消失時取出。③用500 μL異氟烷混合液浸濕少許紗布，塞入50 mL離心管中，制作持續(xù)麻醉小鼠的鼻錐管。固定好小鼠，將鼻錐管靠近小鼠鼻子。

3)灌注及消化：①調(diào)整蠕動泵流速為20 mL/min，導(dǎo)管兩端同時插入緩沖液Ⅰ中，啟動蠕動泵排盡導(dǎo)管中氣泡備用。②插管: 用酒精消毒小鼠腹部，剪開腹部皮膚，向右翻開腸團，暴露出連接肝臟且位于腸系膜上的肝門靜脈。用手術(shù)線將門靜脈打虛結(jié)，將剪掉雙翼的留置針從下部小心插入門靜脈，旋緊留置針和導(dǎo)管接頭，緩慢轉(zhuǎn)動留置針使導(dǎo)管位置擺正, 單手按壓留置針固定。打開肝臟上方的加熱燈，調(diào)整到約20 cm的高度(圖1)。③調(diào)整蠕動泵流速為5 mL/min，用緩沖液Ⅰ 30 mL從門靜脈灌注肝臟，肝臟迅速膨起且顏色均勻變淺即為插管成功，此時迅速剪斷下腔靜脈釋放壓力。④更換緩沖液為緩沖液Ⅱ。每隔幾十秒用鑷子夾住下腔靜脈5 s，保證液體對肝臟進行充分灌注，夾住時可以看到肝臟變腫脹。隨著原位消化的進行，肝臟外觀會迅速變化，包括起伏變小、整體變大、邊緣模糊、肝臟根部有細(xì)小裂紋，灌注6～8 mL時，肝臟恰好不能再隆起時即為消化終點，此時迅速拔出留置針，關(guān)閉蠕動泵。 ⑤ 在35 mm平皿中準(zhǔn)備不含Ⅳ型膠原酶的緩沖液Ⅱ 5 mL，加入DNase Ⅰ 50 μL。從根部取下肝臟，放入皿中，小心去除膽囊。用鑷子扯開肝包膜，輕輕晃動以釋放肝細(xì)胞，此時肝細(xì)胞應(yīng)如云霧狀分散開。⑥將肝細(xì)胞懸液小心轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，置于冰上，用緩沖液Ⅲ 35 mL終止消化，輕輕顛倒幾次后，使用100 μm尼龍濾網(wǎng)過濾。

圖1 小鼠肝臟原位灌注示意圖Fig 1 Schematic diagram of in situ digestion in mice

4)分離細(xì)胞：① 肝細(xì)胞懸液過濾后，50×g離心3 min。獲得的細(xì)胞沉淀重懸于20 mL緩沖液Ⅲ，鋪在20 mL 40% Percoll 上，200×g離心10 min，以去除細(xì)胞碎片和非實質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用20 mL Hank’s緩沖液洗滌兩次，50×g離心3 min。所得沉淀即為原代肝細(xì)胞，加入適量Hank’s緩沖液重懸待用。②錐蟲藍(lán)染色確定細(xì)胞的活性。

5)注意事項：①由于蠕動泵的導(dǎo)管會沉積緩沖液中的鈣離子，術(shù)者需要定期用低濃度醋酸溶液清洗導(dǎo)管，否則膠原酶的消耗量會隨著鈣離子的沉積而逐漸增加。②進行肝臟原位消化時，由于小鼠個體差異，消化的時間不是一個定值，觀察消化終點十分重要，決定了肝細(xì)胞的產(chǎn)量和活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常(CD)組和高脂(HFD)組小鼠體質(zhì)量變化

在造模的不同時間點，CD組和HFD組小鼠平均體質(zhì)量均逐漸增長，HFD組增長幅度較大，顯著高于CD組 (P<0.01)(圖2)。

2.2 正常(CD)組和高脂(HFD)組小鼠肝臟病理特征觀察

2.2.1 小鼠肝臟HE染色結(jié)果:CD組肝臟結(jié)構(gòu)完整，可見肝竇肝索，圍繞中央靜脈呈輻射狀排列；肝細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核位于肝細(xì)胞中央，胞質(zhì)呈淡粉染色；肝臟間質(zhì)未見炎性反應(yīng)(圖3A)。

*P<0.01 compared with CD group圖2 CD組和HFD組的小鼠不同造模時間的平均體質(zhì)量Fig 2 The average body weight of CD group and HFD group mice at different n=6)

HFD組肝臟在第5周時出現(xiàn)輕微空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見少量細(xì)小脂滴(圖3B)；第10周時，肝細(xì)胞腫脹變性，胞質(zhì)內(nèi)存在大小不一的空泡，脂滴增多(圖3C)；第15周時，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量圓形細(xì)小脂滴結(jié)構(gòu)，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)完全被脂滴擠壓至消失，細(xì)胞核被擠壓至細(xì)胞一側(cè)，脂肪變性面積占1/3以上(圖3D)；第20周時， 病變細(xì)胞體積較大， 胞質(zhì)被大量脂質(zhì)物質(zhì)充盈，呈淡粉至透明染色，細(xì)胞核體積小，有些細(xì)胞核被擠壓至細(xì)胞一側(cè)，脂肪變性細(xì)胞占整個組織的50%以上(圖3E)。

2.2.2 小鼠肝臟天狼猩紅染色結(jié)果:CD組小鼠肝臟的天狼猩紅染色呈陰性，肝細(xì)胞及間質(zhì)內(nèi)未見天狼猩紅陽性反應(yīng)，僅在血管壁(含膠原纖維)可見紅色染色的陽性細(xì)胞(圖4A)。

HFD組小鼠第5、10、15周的肝臟天狼猩紅染色呈陰性，肝臟中央靜脈及其周圍膽管的管壁內(nèi)膠原纖維成分呈紅色陽性染色，肝小葉間結(jié)締組織未見陽性，未形成纖維化(圖4B～D)；第20周的小鼠肝臟天狼猩紅染色呈弱陽性，肝細(xì)胞間質(zhì)可見少量紅染的膠原纖維，血管壁(含膠原纖維)可見紅色染色的陽性細(xì)胞(圖4E)。

2.3 高脂(HFD)組小鼠原代肝細(xì)胞的獲取

傳統(tǒng)方法中，每只NAFLD小鼠獲得的肝細(xì)胞數(shù)目<2×107個，細(xì)胞存活率<60%，細(xì)胞純度<60%。肝細(xì)胞腫脹變大，邊緣粗糙，且有較多非實質(zhì)細(xì)胞混雜(圖5A)；經(jīng)過優(yōu)化的本研究方法中，每只NAFLD小鼠可獲得5×107～7×107個肝細(xì)胞， 細(xì)胞存活率≥85%，細(xì)胞純度≥95%。新鮮分離的肝細(xì)胞透亮，呈圓形或橢圓形，邊緣平滑，聚團少(圖5B)。

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×20); D.hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×10); D:hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes obtained by conventional methods(×40); B.hepatocytes obtained by the optimized methods(×40)圖5 小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Fig 5 Morphology of primary mouse hepatocytes

3 討論

由于人類飲食結(jié)構(gòu)的改變，全球NAFLD患者逐年增多。據(jù)報道, 50%的NAFLD患者會進展為肝纖維化，少數(shù)會發(fā)展成肝硬化，甚至最終進展為肝衰竭[7]。本研究模擬人類發(fā)病原因，利用高脂飲食誘導(dǎo)了NAFLD的小鼠模型，其中CD組小鼠無明顯脂滴沉積，未形成脂肪肝；HFD組小鼠由于飲食的改變，肝臟發(fā)生脂肪變性，病變面積隨著時間的延長逐漸增加，在15周時開始超過1/3，NAFLD模型構(gòu)建成功[8]，到20周時脂肪變性面積已達50%以上，甚至開始出現(xiàn)肝纖維化。

NAFLD原代肝細(xì)胞接近機體肝臟病理狀態(tài)，在發(fā)病機制及藥物代謝等研究中扮演重要角色[9]。NAFLD 原代肝細(xì)胞相對于正常原代肝細(xì)胞更加脆弱, 難以分離，并且目前獲取NAFLD 原代肝細(xì)胞的研究仍比較少。本研究以經(jīng)典的 Seglen 兩步灌流法為基礎(chǔ)[4-6]，改進得到了一種可以獲得高產(chǎn)量、高活性、高純度NAFLD原代肝細(xì)胞的方法。

在原位灌注小鼠肝臟時，本方法首先精準(zhǔn)控制了消化的溫度，將緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ進行42 ℃預(yù)熱，麻醉時在肝臟上方使用加熱燈加熱，最大限度保證了消化酶的工作溫度接近37 ℃，一方面減少了對肝細(xì)胞的刺激，另一方面使消化酶更好地發(fā)揮作用，節(jié)省了Ⅳ型膠原酶的用量。其次，本研究將Ⅳ型膠原酶的濃度由傳統(tǒng)方法中的0.6 mg/mL降到0.4 mg/mL，使得消化更加溫和，容易找到一個更加精確的消化終點，既獲得了高產(chǎn)量的肝細(xì)胞，又提高了肝細(xì)胞的存活率。

對于體外分離肝細(xì)胞，目前大多實驗室主要采用直接靜置和密度梯度離心兩種方法，直接靜置會導(dǎo)致肝細(xì)胞純度下降，摻入過多肝臟非實質(zhì)細(xì)胞。而常規(guī)的密度梯度離心由于離心力較大，往往對肝細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響。普通肝細(xì)胞分離使用50% Percoll分離液，脂肪肝細(xì)胞由于有脂滴沉積而導(dǎo)致密度下降，故而采用常規(guī)的分離液濃度會降低肝細(xì)胞的產(chǎn)量。本研究采用低速(200×g)密度梯度離心和普通低速離心(50×g)相結(jié)合的方式，使用40% Percoll分離液，使肝細(xì)胞的活性、產(chǎn)量和純度進一步得到提高。

綜上，本研究構(gòu)建了NAFLD的小鼠模型，揭示了第5、10、15和20周小鼠肝臟的病理特征，并構(gòu)建了一種高效、穩(wěn)定的獲取高質(zhì)量NAFLD小鼠肝細(xì)胞的實驗方法，對小鼠模型中NAFLD的進一步研究有一定參考價值。