沈 杰，嚴(yán) 潔，鐘 明，龐睿娟，羅永杰

(成都市第二人民醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科；2.檢驗(yàn)科， 四川 成都 610017；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 四川 成都 610072)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，是癡呆癥的最常見病因，其嚴(yán)重威脅著全球數(shù)百萬(wàn)老年人[1]。AD病因復(fù)雜，大量研究表明Aβ在大腦中的異常沉積是AD發(fā)病核心，并通過(guò)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)之間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)變性[2]。因此，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)可能為AD的治療和預(yù)防提供潛在策略。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可作為微小RNA(miRNA)的誘餌影響mRNA翻譯，在維持細(xì)胞生理以及包括神經(jīng)退行性疾病如AD等一系列人類疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究指出lncRNA核內(nèi)小RNA宿主基因14(SNHG14)在AD患者中高表達(dá)，運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)降低SNHG14水平來(lái)改善AD小鼠認(rèn)知障礙和炎性反應(yīng)活動(dòng)[4]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-142-5p是SNHG14的潛在靶點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-142-5p通過(guò)調(diào)控自噬和影響細(xì)胞活力在體外帕金森病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)劑作用[5]。然而，SNHG14是否靶向miR-142-5p參與調(diào)控AD進(jìn)展并未闡明。本研究探討了SNHG14和miR-142-5p在寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制，旨在為AD診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2018年1月至2019年12月在成都市第二人民醫(yī)院確診的AD患者41例，其中女15例，男26例，年齡(66.7±7.3)歲。同期選擇27例健康體檢者作為對(duì)照(NC)組、NC組和AD組受試者的年齡、性別無(wú)差異，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：AD患者符合美國(guó)神經(jīng)病學(xué)、語(yǔ)言障礙和卒中-老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康者以簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)體檢者的認(rèn)知功能。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期有過(guò)感染史；自身免疫疾病患者；心臟、腎等重要臟器功能障礙者；腫瘤患者；高血壓、糖尿病等慢性病患者。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。抽取受試者空腹靜脈血5 mL置于肝素采血管，1 h內(nèi)4 ℃離心取血漿樣本，保存于-80 ℃冰箱。

鼠源神經(jīng)細(xì)胞系PC12(ATCC公司)；si-SNHG14、si-NC、miR-142-5p mimics、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-142-5p、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(上海生工生物公司)；寡聚態(tài)Aβ(Sigma-Aldrich公司)；cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientifica公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司)；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物公司)；FITC-annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒(上海澤葉生物公司)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒和IL-10 ELISA試劑盒(Biovision公司)；羊抗兔IgG、cleaved Caspase-3兔多克隆抗體和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)AD患者血漿中SNHG14、miR-142-5p水平:先用Trizol試劑提取血漿總RNA，然后用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)SNHG14(GAPDH為內(nèi)參)、miR-142-5p(U6為內(nèi)參)表達(dá)，并采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。SNHG14上游5′-GGGT GTTTACGTAGACCAGAACC-3′，下游5′-CTTCCAAA AGCCTTCTGCCTTAG-3′；GAPDH上游5′-CGCTCT CTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游5′-ATCCGTTGACTCC GACCTTCAC-3′；miR-142-5p上游5′-AAAGTAGAAA GCACTAC-3′，下游5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；U6上游5′-CCCCTGGATCTTATCAGGCTC-3′，下游5′-GCCATCTCCCCGGACAAAG-3′。

1.2.2 細(xì)胞的分組和處理:將PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清+1%雙抗+89% DMEM培養(yǎng)液在飽和濕度、37 ℃、含5% CO2溫箱孵育，細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)用胰蛋白酶消化并傳代。選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種24孔板，用脂質(zhì)體2000將si-SNHG14、si-NC、miR-142-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+ anti-miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-142-5p分別轉(zhuǎn)染50%匯合PC12細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用20 μmol/L的寡聚態(tài)Aβ孵育PC12細(xì)胞24 h建立神經(jīng)細(xì)胞損傷模型[6]，記為模型組。未處理PC12細(xì)胞記為對(duì)照組。用含20 μmol/L的寡聚態(tài)Aβ孵育上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并記為模型+si-NC組、模型+si-SNHG14組、模型+miR-NC組、模型+ miR-142-5p組、模型+si-SNHG14+anti-miR-NC組、模型+si-SNHG14+ anti-miR-142-5p組。

1.2.3 CCK-8法測(cè)量細(xì)胞增殖抑制率:將未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后的PC12細(xì)胞分別接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)/孔，運(yùn)用20 μmol/L的寡聚態(tài)Aβ孵育PC12細(xì)胞24 h，每孔補(bǔ)充10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)A/對(duì)照A)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡:寡聚態(tài)Aβ孵育PC12細(xì)胞24 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，隨后用200 μL結(jié)合緩沖液重懸。加入10 μL FITC-annexin V和5 μL碘化丙啶室溫避光染色30 min。1 h上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，用FlowJo軟件分析凋亡細(xì)胞比例。

1.2.5 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-10水平:寡聚態(tài)Aβ孵育PC12細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書分析上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將包含miR-142-5p結(jié)合位點(diǎn)的SNHG14野生(WT)序列插入pmirGLO報(bào)告載體構(gòu)建WT-SNHG14質(zhì)粒；同時(shí)，構(gòu)建不含miR-142-5p結(jié)合位點(diǎn)的SNHG14突變(MUT)質(zhì)粒MUT-SNHG14。將這些載體與miR-142-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.7 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)cleaved-caspase3蛋白水平:RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后進(jìn)行濕法分離。用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，并用cleaved-caspase 3抗體、GAPDH抗體4 ℃孵育10 h，然后用羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)信號(hào)，并使用Image Lab軟件對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3）間接性關(guān)聯(lián)關(guān)系。間接性關(guān)聯(lián)是指同一視圖或者不同視圖檔案特征之間存在的不同于同一性關(guān)聯(lián)和相關(guān)性關(guān)聯(lián)，需要通過(guò)特征關(guān)聯(lián)圖路徑拓?fù)潢P(guān)系推導(dǎo)出的關(guān)聯(lián)關(guān)系。不失一般性地假設(shè)f1,f2,f3∈R，若e1=f1?f2，e2=f2?f3則有e=e1°e2=f1?f3。給定路徑e可包含ei的閾值，當(dāng)e＜δ時(shí)，所屬路徑經(jīng)過(guò)不相鄰的結(jié)點(diǎn)之間存在間接性關(guān)聯(lián)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 SNHG14和miR-142-5p在AD患者血漿中的表達(dá)

與NC組比較，AD患者血漿中SNHG14表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-142-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖1)。

A.SNHG14 is highly expressed in the plasma of AD patients; B.miR-142-5p is lowly expressed in the plasma of AD patients(27 normal cases and 41 AD patients)； *P<0.05 compared with NC group圖1 NC、AD患者血漿內(nèi)SNHG14和miR-142-5p表達(dá)的檢測(cè)Fig 1 Detection of SNHG14 and miR-142-5p expression in plasma of NC(n=27) and AD (n=41)

2.2 沉默SNHG14對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響

與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞抑制率、凋亡率、SNHG14表達(dá)、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，miR-142-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型+si-NC組比較，模型+si-SNHG14組PC12細(xì)胞抑制率、凋亡率、SNHG14表達(dá)、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，miR-142-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖2，表1)。

2.3 沉默SNHG14對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中炎性因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)，IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與模型+si-NC組比較，模型+si-SNHG14組PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.05)(表2)。

2.4 SNHG14和miR-142-5p的靶向關(guān)系

Starbase預(yù)測(cè)到miR-142-5p與SNHG14存在連續(xù)互補(bǔ)序列，見圖3。miR-142-5p mimics和WT-SNHG14共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與miR-NC和WT-SNHG14共轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比顯著降低(P<0.05)(表3)。

A.SNHG14 silencing promotes apoptosis of PC12 cell induced by oligomeric Aβ; B.SNHG14 silencing promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 cell induced by oligomeric Aβ

表1 沉默SNHG14對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的檢測(cè)Table 1 Detection of SNHG14 silencing on PC12 cell damage induced by oligomeric

表2 沉默SNHG14對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中炎性因子的檢測(cè)

圖3 SNHG14和miR-142-5p的互補(bǔ)序列Fig 3 Complementary sequence of SNHG14 and miR-142-5p

2.5 miR-142- 5p對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)的影響

與模型+miR-NC組比較，模型+miR-142-5p組PC12細(xì)胞miR-142-5p表達(dá)、培養(yǎng)液中IL-10水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞抑制率、凋亡率、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)以及培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)(圖4，表4)。

2.6 抑制miR-142- 5p對(duì)沉默SNHG14處理的寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)的影響

與模型+si-SNHG14+anti-miR-NC組比較，模型+si-SNHG14+anti-miR-142-5p組PC12細(xì)胞miR-142-5p表達(dá)、培養(yǎng)液中IL-10水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞抑制率、凋亡率、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)以及培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)(圖5，表5)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Table 3 Double luciferase report

3 討論

AD是最嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病之一，其開始進(jìn)展緩慢，隨著時(shí)間的推移而逐步惡化，闡明AD的發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找有效的治療靶點(diǎn)十分重要。lncRNA是近年來(lái)AD相關(guān)研究的熱點(diǎn)，血漿中l(wèi)ncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)水平可能是AD患者診斷的潛在生物標(biāo)志物[7]；lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)參與寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[8]。SNHG14是研究最廣泛的lncRNA之一，其在癌和血管疾病中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)AD患者血漿和寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中SNHG14表達(dá)增加，沉默SNHG14可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)cleaved-caspase 3表達(dá)，表明SNHG14在AD進(jìn)展中是一種正向調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)炎性損傷可能加劇AD發(fā)病機(jī)制，Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)促炎因子大量產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)[9]。

A.miR-142-5p promotes apoptosis of PC12 cells induced by oligomeric Aβ; B.miR-142-5p promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 cells induced by oligomeric Aβ

表4 miR-142-5p對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)的影響

A.inhibiting miR-142-5p promotes apoptosis of PC12 induced by silencing SNHG14-treated oligomeric Aβ; B.inhibiting miR-142-5p promotes cleaved-caspase 3 protein expression of PC12 induced by silencing SNHG14-treated oligomeric Aβ

表5 抑制miR-142- 5p對(duì)沉默SNHG14處理的寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷炎性因子的檢測(cè)

有報(bào)道稱，SNHG14可促進(jìn)糖氧剝奪復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損炎性反應(yīng)[10]。在帕金森病細(xì)胞模型中，SNHG14下調(diào)可抑制促炎因子產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡[11]。與上述發(fā)現(xiàn)類似，本研究中沉默SNHG14可促進(jìn)抗炎因子IL-10水平，降低促炎因子TNF-α和IL-6水平，表明沉默SNHG14可改善寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性損傷。

既往研究報(bào)道SNHG14可調(diào)節(jié)多種miRNA表達(dá)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)在AD患者血漿和寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中miR-142-5p表達(dá)降低，證實(shí)miR-142-5p是SNHG14的直接靶點(diǎn)。miR-142-5p是多種細(xì)胞損傷模型的保護(hù)因子，miR-142-5p過(guò)表達(dá)可減輕缺氧引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和活力下降[14]。上調(diào)miR-142-5p水平能夠改善急性腎損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-142-5p可減輕寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。沉默SNHG14可逆轉(zhuǎn)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的miR-142-5p表達(dá)下降，抑制miR-142-5p表達(dá)顯著減弱沉默SNHG14對(duì)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、炎性因子水平的影響，進(jìn)一步證實(shí)SNHG14通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-142-5p表達(dá)促進(jìn)寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)AD進(jìn)展。

綜上所述，AD患者血漿中SNHG14表達(dá)上調(diào)，miR-142-5p表達(dá)下調(diào)。沉默SNHG14通過(guò)上調(diào)miR-142-5p水平可抑制寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)，從而改善神經(jīng)元損傷。這些發(fā)現(xiàn)可能為SNHG14和miR-142-5p在AD的發(fā)生發(fā)展中的作用提供新的見解，也可能為AD的治療提供新的靶點(diǎn)。