羅陽(yáng) 彭芳 李磊 劉文博 劉寒艷

1廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，生殖醫(yī)學(xué)中心（廣州 510150）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（廣州 510150）

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）通過(guò)將單個(gè)精子直接注射到成熟的卵母細(xì)胞中進(jìn)行授精，是目前治療男性因素不孕癥和既往常規(guī)體外受精（in vitrofertilization，IVF）發(fā)生失敗患者最有效的輔助生殖技術(shù)［1］。目前ICSI 平均受精率高達(dá)80%，但仍有1% ～5%的ICSI 周期發(fā)生完全受精失敗，其主要原因是卵子激活失敗或不足［2-3］。臨床上對(duì)該部分ICSI 受精失敗的治療策略是進(jìn)行輔助卵子激活（assisted oocyte activation，AOA），即通過(guò)機(jī)械激活，電激活和化學(xué)試劑激活等方法人工引發(fā)卵胞漿內(nèi)鈣離子震蕩，輔助完成卵子激活過(guò)程［4-6］；其中采用鈣離子載體A23187 和離子霉素的化學(xué)試劑激活目前已應(yīng)用于較多生殖中心［7］。ICSI 聯(lián)合AOA（ICSIAOA）在ICSI 受精失敗患者中已獲得臨床妊娠，并分娩健康嬰兒［8］，但總體而言，ICSI-AOA 在改善既往ICSI 受精失敗患者方面的樣本量仍然不足，安全性仍不確定，尤其對(duì)于目前最新的離子霉素方案的有效性和安全性有待進(jìn)一步確定［9-10］。本研究回顧性分析了在我院生殖醫(yī)學(xué)中心實(shí)施離子霉素方案的ICSI-AOA 治療患者的臨床資料，以探討對(duì)ICSI 受精失敗患者實(shí)施AOA 的有效性和安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年6月至2019年10月期間在本中心接受ICSI-AOA 方案治療周期患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）上次ICSI 受精失?。唬?）成熟卵子≥6 個(gè)。本研究中的ICSI 受精失敗分為完全受精失?。ㄊ芫?0%）和受精率低（受精率＜30%）。共納入56 例接受ICSI-AOA 治療周期的患者，其56 個(gè)ICSI-AOA 治療周期被納入ICSIAOA 組；患者之前未進(jìn)行AOA 治療的56 個(gè)ICSI受精失敗周期作為對(duì)照組。此外，由于對(duì)照組分娩數(shù)據(jù)樣本量偏小，因此，在進(jìn)行新生兒結(jié)局比較時(shí)，本研究選擇本中心同期進(jìn)行的常規(guī)ICSI 來(lái)源的997 例患者分娩數(shù)據(jù)作為對(duì)照組。本研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（生倫審［2018］第004號(hào)），納入的所有患者均同意并簽署書面知情同意書。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 對(duì)患者進(jìn)行控制性促排卵的藥物有重組人促卵泡激素-果納芬（Gonal-F）和促性腺激素釋放激素拮抗劑（Cetrotide）由瑞士Serono 公司提供；促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（Diphereline）由法國(guó)Ipsen Pharma Biotech 公司提供；輔助卵子激活試劑離子霉素（Ionomycin）由德國(guó)Merck KgAA 公司提供。胚胎培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基由瑞典Vitrolife 公司提供，且提前配置好并于37 ℃，6%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜平衡待用。胚胎觀察操作使用的倒置顯微鏡（ECLIPSE Ti-S），體視顯微鏡（SM2645）均由日本Nikon 公司提供；胚胎培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)箱均由澳大利亞Cook 公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵子收集和ICSI 監(jiān)測(cè)到卵泡發(fā)育有至少1 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm，或3 個(gè)卵泡的平均直徑≥16 mm時(shí)進(jìn)行扳機(jī)，34 ～36 h后超聲引導(dǎo)下進(jìn)行經(jīng)陰道取卵。收集卵冠丘復(fù)合物，立即置于G-IVF Plus 培養(yǎng)基中（Vitrolife），并在培養(yǎng)箱中保持6%CO2和5%的O2在37 ℃下培養(yǎng)2 ～3 h。通過(guò)透明質(zhì)酸酶溶液和機(jī)械吹吸處理對(duì)卵冠丘復(fù)合物進(jìn)行脫顆粒，去除顆粒細(xì)胞后的裸露卵子進(jìn)行成熟度評(píng)估，僅對(duì)成熟的MII 期卵子（Metaphase II，MII）進(jìn)行ICSI 操作。

1.3.2 輔助卵子激活 AOA程序參照Nasr-Esfahani等人先前的方法進(jìn)行［11］。在ICSI注射后，立即將卵子轉(zhuǎn)移到以G-IVF Plus 培養(yǎng)基配置的激活液中，即10 μmol/L 離子霉素培養(yǎng)處理10 min。激活后，以G-IVF Plus 漂洗至少3 次，隨后置于G1-plus 培養(yǎng)基（Vitrolife）中繼續(xù)培養(yǎng)直至受精觀察。

1.3.3 體外受精和胚胎培養(yǎng) 授精16～18 h 后顯微鏡下觀察評(píng)估受精情況，只有可見2 個(gè)原核的（two pronucleus，2PN）為正常受精卵，顯示單個(gè)或兩個(gè)以上PN 的胚胎被認(rèn)為是異常受精并被丟棄。將正常受精卵轉(zhuǎn)移至新配置的培養(yǎng)基中進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，以該天為胚胎發(fā)育第1 天，第3 天時(shí)再次進(jìn)行卵裂期胚胎發(fā)育情況的評(píng)估，評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)為：卵裂球數(shù)目7～9 個(gè)，大小均勻，且胚胎中碎片程度≤20% 評(píng)為優(yōu)質(zhì)胚胎，卵裂球數(shù)目≥5 個(gè)，且胚胎中碎片≤20%，則評(píng)為可利用胚胎［12］。在第3天胚胎移植和玻璃化冷凍處理后，其余的胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至第5 或第6 天，囊胚評(píng)分參考Gardner 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，即擴(kuò)張的B4-B6 囊胚且至少一個(gè)B 的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和（或）滋養(yǎng)外胚層（TE）或更好等級(jí)的囊胚可以用于移植［13］。

臨床妊娠被定義為妊娠第5 周經(jīng)陰道超聲觀察到有胎心的孕囊，流產(chǎn)被定義為在妊娠20 周之前失去臨床妊娠，活產(chǎn)定義為至少分娩一名活產(chǎn)嬰兒。具有胎心搏動(dòng)的孕囊數(shù)目同移植胚胎數(shù)目比例為胚胎種植率；臨床妊娠患者數(shù)目同進(jìn)行胚胎移植患者數(shù)目的比例為臨床妊娠率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或例（%）表示；組間比較采用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 納入研究患者的平均年齡為31.46歲，其平均體質(zhì)指數(shù)為21.57，平均基礎(chǔ)FSH、LH、抗苗勒氏管激素（AMH）水平分別為5.62、3.71 U/L和5.75 ng/mL。平均不孕年限為5.75年，接受輔助生殖治療周期平均2.67 次。對(duì)患者的不孕癥類型分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)性不孕不育占據(jù)主導(dǎo)，為80.36%，繼發(fā)性不孕癥比例為19.64%；男性因素占病例的71.43%，女性因素為5.36%，23.21%的病例同時(shí)具有男性和女性因素。在取精方式上，76.79%的病例為射出精，23.21% 的病例采用手術(shù)取精。這些數(shù)據(jù)表明本研究中接受ICSI-AOA 治療的患者主要來(lái)自于原發(fā)性不孕或男性因素，見表1。

表1 患者的一般資料Tab.1 Characteristics of included patients ±s

表1 患者的一般資料Tab.1 Characteristics of included patients ±s

一般情況女方年齡不孕年限治療周期體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）基礎(chǔ)FSH 水平（U/L）基礎(chǔ)LH 水平（U/L）AMH（ng/mL）不孕類型［例（%）］原發(fā)不孕繼發(fā)不孕不孕因素［例（%）］男方因素非男方因素雙方因素取精方式［例（%）］射出精手術(shù)患者（n=56）31.46±3.80 5.75±2.83 2.67±0.57 21.57±2.66 5.62±2.33 3.71±1.38 5.75±4.09 45（80.36）11（19.64）40（71.43）3（5.36）13（23.21）43（76.79）13（23.21）

2.2 ICSI-AOA組和對(duì)照組的臨床特征比較 患者兩次治療前后的啟動(dòng)時(shí)促性腺激素（gonadotropin，Gn）劑量，總Gn 劑量，促排時(shí)間，以及扳機(jī)日血清孕酮和雌二醇水平，子宮內(nèi)膜厚度均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。這表明兩組之間的周期特征是相似的。

表2 ICSI-AOA 組和對(duì)照組的臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics between ICSI-AOA and control groups ±s

表2 ICSI-AOA 組和對(duì)照組的臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics between ICSI-AOA and control groups ±s

一般情況啟動(dòng)Gn 劑量（IU）總Gn 劑量（IU）促排時(shí)間（d）扳機(jī)日血清孕酮（nmol/L）扳機(jī)日血清雌二醇（pg/mL）子宮內(nèi)膜厚度（mm）ICSI-AOA 組（n=56）181.69±59.60 2 093.02±819.55 10.86±1.93 2.56±1.79 12 649.81±5 786.688 10.45±2.14對(duì)照組（n=56）178.69±63.94 2 228.98±846.34 11.23±2.06 2.58±1.55 12 569.93±5 146.717 10.65±2.20 P 值0.822 0.449 0.394 0.935 0.944 0.656

2.3 ICSI-AOA組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較 如表3 所示，兩組的獲卵數(shù)目和注射MII 卵子數(shù)目分別為14.25 個(gè)、10.58 個(gè)以及13.44 個(gè)、10.02 個(gè)，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ICSI-AOA 組的總受精率和正常受精率為75.38%和65.94%，顯著高于對(duì)照組的17.87%和15.88%（P＜0.001）。同時(shí)，ICSI-AOA 組的完全受精失敗率和低受精率（1.79%、7.14%）都低于對(duì)照組（60.71%、39.29%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。AOA 組的卵裂率為97.99%，其數(shù)值高于對(duì)照組的94.95%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

ICSI-AOA組的D3可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于對(duì)照組（42.24%vs.27.66%；14.88%vs.4.76%，P＜0.05），相應(yīng)地，無(wú)可利用胚胎周期率上，ICSI-AOA 組則顯著低于對(duì)照組（25.0%vs.64.29%，P＜0.05）。ICSI-AOA 組最終的囊胚形成率為14.89%，數(shù)值上高于對(duì)照組的8.00%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AOA組中可利用胚胎來(lái)源的囊胚形成率為62.5%，由于對(duì)照中的可利用的胚胎數(shù)目有限，且被用于移植或玻璃化凍存，沒有進(jìn)行可利用胚胎的囊胚培養(yǎng)，因此沒有此項(xiàng)數(shù)據(jù)，見表3。

表3 ICSI-AOA 組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較Tab.3 Comparison of laboratory outcomes between ICSI-AOA and control groups 例（%）

2.4 ICSI-AOA 組和對(duì)照組的臨床結(jié)果比較 臨床結(jié)局方面結(jié)果見表4，從取卵周期和移植周期分別計(jì)算臨床妊娠率，ICSI-AOA組的分別為53.57%和55.56%，顯著高于對(duì)照組的7.14%和21.05%（P＜0.001）。種植率上，ICSI-AOA 組顯著高于對(duì)照組（43.48%vs. 15.38%，P＜0.001）；在流產(chǎn)率上，ICSIAOA 組的數(shù)值低于對(duì)照組（7.41%vs. 10.53%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從取卵周期和移植周期分別計(jì)算活產(chǎn)率，ICSI-AOA 組的分別為42.86%和44.44%，顯著高于對(duì)照組的1.79%和5.26%（P＜0.001）。

2.5 ICSI-AOA 組和對(duì)照組的新生兒結(jié)果比較 ICSI-AOA 組共有7 例雙胎和17 例單胎妊娠，分娩31 例健康嬰兒，原對(duì)照組分娩1 例健康嬰兒。鑒于對(duì)照組分娩數(shù)據(jù)太少，選擇本中心同期進(jìn)行的常規(guī)ICSI 來(lái)源的997 例患者分娩數(shù)據(jù)作為對(duì)照組。如表5 所示，兩組在產(chǎn)婦特征包括患者年齡、不孕類型，不孕因素、體質(zhì)指數(shù)、不孕年限、移植胚胎個(gè)數(shù)、移植胚胎期、移植胚胎類型、分娩方式差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；新生兒情況包括雙胞胎比例、孕周、出生體質(zhì)量、性別比（男性）、早產(chǎn)兒（＜37 周）、大于胎齡兒（＞40 周）以及低出生體質(zhì)量（＜2 500 g）和先天性缺陷方面均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 ICSI-AOA 組和常規(guī)ICSI 組新生兒情況比較Tab.5 Comparison ofneonatal outcomes between ICSI-AOA and conventional ICSI groups ±s

組別患者年齡不孕類型（率）原發(fā)不孕繼發(fā)不孕不孕因素（率）男方因素女方因素雙方因素體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）不孕年限（年）移植胚胎個(gè)數(shù)（率）1 2移植胚胎期（率）卵裂胚非卵裂胚移植胚胎類型（率）新鮮胚冷凍胚分娩方式（率）剖腹產(chǎn)陰道產(chǎn)新生兒情況（率）雙胎率孕周出生體質(zhì)量（kg）性別比（率，男）早產(chǎn)兒（率，＜37周）大于胎齡兒（率，＞40周）低出生體質(zhì)量（率，＜2 500 g）先天性缺陷ICSI-AOA組（n=24）30.67±4.22 21/24（87.50）3/24（12.50）17/24（70.83）3/24（12.50）4/24（16.67）21.56±2.61 5.67±3.00 5/24（20.83）19/24（79.17）15/24（62.50）9/24（37.50）8/24（33.33）16/24（66.67）18/24（75.00）6/24（25.00）7/24（29.17）37.88±1.94 2.92±0.40 18/31（58.06）7/31（22.58）2/31（6.45）7/31（22.58）0常規(guī)ICSI組（n=997）31.29±4.17 739/997（74.12）258/997（25.88）650/997（65.20）90（9.03）257（25.78）21.48±2.91 4.80±3.19 280/997（28.08）717/997（71.92）548/997（54.96）449/997（45.04）316/997（31.70）681/997（68.30）626/997（62.79）371/997（37.21）221/997（22.17）37.96±2.15 2.91±0.60 611/1 218（50.16）288/1 218（23.65）44/12 181（3.6）269/1 218（22.09）10/1 218（0.82）P值0.478 0.138 0.553 0.888 0.175 0.434 0.463 0.865 0.221 0.416 0.846 0.846 0.385 0.890 0.318 0.948 1.000

3 討論

目前AOA 主要采用化學(xué)試劑鈣離子載體（A23187 和離子霉素）的方法進(jìn)行，其機(jī)制為將卵母細(xì)胞暴露于鈣離子載體溶液中，使卵子胞質(zhì)中的胞內(nèi)鈣離子水平立即顯著升高，激活下游蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而完成卵子激活。已有研究中采用A23187 的治療數(shù)據(jù)較多［14］，但目前有研究認(rèn)為采用離子霉素行AOA 的效果更好［15］。本研究中，筆者評(píng)估了采用離子霉素進(jìn)行AOA 對(duì)前次ICSI 周期受精失敗患者的治療結(jié)果，這部分患者在接受ICSI-AOA 治療之前，患有不孕癥的平均年限為5.75年，并已經(jīng)歷平均2.67 個(gè)輔助生殖治療周期。我們發(fā)現(xiàn)離子霉素顯著提高了總受精率和正常受精率，降低了完全受精失敗率和低受精率的概率。離子霉素處理提高了受精率，從而在第3 天提供了更多的可移植胚胎，顯著降低了不可移植胚胎周期率（P＜0.001）。意外的是，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AOA 組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著增加（14.88%vs.4.76%，P＜0.05），提示離子霉素可能會(huì)改善胚胎的發(fā)育能力，這與既往的同類型研究明顯不同［16］。此外，EBNER 等［17］在一項(xiàng)前瞻性研究中，通過(guò)排除重度男性因素不孕和ICSI 后受精率＜30%的患者，因?yàn)檫@是進(jìn)行輔助卵子激活的常規(guī)指征；然后他們通過(guò)Ca2+離子載體對(duì)胚胎發(fā)育完全停滯或遲緩，以及囊胚形成率低患者的研究，發(fā)現(xiàn)AOA 可以明顯改善這些有胚胎發(fā)育問題患者的治療結(jié)局?？紤]到上述證據(jù)，認(rèn)為離子霉素治療在改善有胚胎發(fā)育障礙或ICSI 受精失敗患者的胚胎質(zhì)量方面具有巨大潛力。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)AOA 不僅提高了植入率，而且還顯著增加了臨床妊娠和活產(chǎn)率，這在以前同類型研究中未見報(bào)道［16］。本研究數(shù)據(jù)表明，離子霉素處理后提高了受精率，提供了更多的可利用胚胎，并會(huì)提高胚胎的發(fā)育能力，且提高了臨床妊娠/活產(chǎn)率，改善了患者的治療結(jié)局。

由于AOA應(yīng)用于臨床，其安全性一直是重要的關(guān)注點(diǎn)［18］，DEEMEH等［19］采用離子霉素方案的AOA探討其安全性，發(fā)現(xiàn)ICSI-AOA與常規(guī)ICSI在宮內(nèi)死胎、早產(chǎn)、出生體質(zhì)量、生長(zhǎng)速度、新生兒重癥監(jiān)護(hù)室住院情況、年齡相關(guān)異常行為、新生兒身心健康等指標(biāo)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MILLER等［20］研究發(fā)現(xiàn)，ICSI-AOA 和常規(guī)ICSI 出生新生兒的出生體質(zhì)量、孕周和胎兒性別比上是相似的。本研究中，考慮到對(duì)照組樣本量相對(duì)較小，采用同期常規(guī)ICSI患者新生兒數(shù)據(jù)作為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)AOA組同對(duì)照組在雙胎比例、孕周、出生體質(zhì)量、性別比等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組的早產(chǎn)（＜37周）、大于胎齡兒（＞40周）以及低出生體質(zhì)量（＜2 500 g）和先天性缺陷方面發(fā)生率相似（P＞0.05）。

綜上所述，本研究數(shù)據(jù)表明，離子霉素行AOA增加了受精率和可利用胚胎率；并提高了優(yōu)質(zhì)胚胎率，改善了胚胎的發(fā)育潛能。離子霉素處理還提高了著床率，增加了臨床妊娠/活產(chǎn)率，以及累積妊娠/活產(chǎn)率。此外，離子霉素行AOA 沒有增加與產(chǎn)科和新生兒結(jié)果相關(guān)的異常風(fēng)險(xiǎn)。需要指出的是，盡管本研究的樣本量大于其他類似研究的樣本量，但仍然存在樣本量偏小，且為回顧性研究的局限性。因此，本研究認(rèn)為離子霉素能夠改善既往ICSI 后受精失敗患者的治療結(jié)局，但更大樣本量的研究，尤其是安全性評(píng)估方面仍然是必要的。