吳升浩 胡楊楊 劉曉明

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（浙江溫州 325000）

不孕不育已經(jīng)成為一個全球性的醫(yī)療和社會問題。近年來，不孕不育癥的發(fā)病率在發(fā)達國家和發(fā)展中國家都在持續(xù)上升。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，不孕不育的病因接近一半是由男性因素引起的，其中無精子癥占到了男性不育的5%。無精子癥可分為梗阻性無精子癥（OA）和非梗阻性無精子癥（NOA）［1-3］。梗阻性無精子癥是生殖男科的一種常見疾病，占無精子癥的40%。該疾病是由于睪丸網(wǎng)和射精管之間任一位置的阻塞導致的［4-5］。隨著在1997年有學者首次報道了通過經(jīng)皮睪丸穿刺精子抽吸術（TESA）獲得的睪丸精子用于卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）進行輔助生殖，該項技術目前得到了廣泛的應用，為無精子癥患者帶來了生育的希望。近年來，在輔助生殖中凍融胚胎移植（FET）比例不斷增加，其妊娠結局也受到了越來越多的關注［6］。目前有較多研究報道了關于試管嬰兒中新鮮移植與FET 對妊娠結局的影響，張敏等［7］比較了卵巢正常反應患者新鮮胚胎移植和第1 次FET 的臨床結局，發(fā)現(xiàn)新鮮胚胎移植和FET 的臨床結局是相似的。而LIU 等［8］在2019年開展的一項回顧性隊列研究中發(fā)現(xiàn)，對于獲卵數(shù)在3 ～10 個的女性患者FET 可以獲得更好的妊娠結局。另外有研究比較了新鮮胚胎移植和FET后妊娠早期胎兒生長發(fā)育的速度，發(fā)現(xiàn)FET 胎兒妊娠早期生長速度明顯升高，認為這可能與巨大兒有關［9］。但是上述類似研究中男性配偶使用的均是射出精子，由于睪丸精子與射出精子相比在成熟度和功能結構上均有所不同［10］，而且目前尚沒有關于使用睪丸精子進行ICSI 后新鮮和凍融胚胎移植妊娠結局的研究，因此本文回顧性分析了2017-2020年在本中心行TESA 獲得睪丸精子并后續(xù)行ICSI 助孕的OA 患者資料，探討使用睪丸精子ICSI 后的囊胚移植策略，這對OA 患者的輔助生殖助孕具有重要意義，也為今后臨床上OA 患者根據(jù)個體差異化特征選擇不同移植策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月至2020年12月在我院生殖中心行TESA-ICSI 的患者夫妻資料。納入標準：（1）男方為無精子癥患者，穿刺睪丸有精子；（2）女方年齡＜40 歲，均為首次行TESAICSI 并行新鮮或者冷凍囊胚移植，移植胚胎為1 ～2枚評分3BC或3BC以上囊胚；（3）女方卵巢儲備功能正常：抗苗勒管激素（AMH）＞1.2 ng/mL，基礎卵泡刺激素（FSH）≤10 IU/L，竇卵泡計數(shù)（AFC）≥5個。排除標準：（1）患者信息不全或缺失；（2）女方有嚴重影響胚胎種植的因素：嚴重輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、宮腔粘連、子宮畸形、免疫功能異常和凝血功能異常等；（3）配偶有可能干擾妊娠結果的其他疾病。本研究共納入340個移植周期，其中凍融囊胚行冷凍移植的有162 周期（冷凍周期組），新鮮囊胚移植的有178周期（新鮮周期組）。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理編號：2021-K-74-02），符合《赫爾辛基宣言》的宗旨。所有參與者均獲知情并簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案和卵母細胞的收集 促排卵方案采用本生殖中心常規(guī)的卵泡期超長方案（C1），所有納入患者均在月經(jīng)周期第1 ～5天注射3.75 mg長效醋酸亮丙瑞林（貝依，上海麗珠制藥）降調節(jié)。在成功降調后的第32 ～38 天使用促性腺激素（果納芬，瑞士雪蘭諾大藥廠）開始啟動促排卵治療，劑量根據(jù)血清雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、孕酮（P）水平和竇卵泡的大小來調整。當有2 ～3個卵泡直徑≥18 mm，或至少有1 個卵泡直徑≥20 mm時，選擇注射用絨促性素（HCG，上海麗珠制藥）10 000 U扳機。36 ～38 h后經(jīng)陰道超聲引導下取卵。

1.2.2 睪丸精子的獲取 平臥位，常規(guī)消毒鋪巾，用2%的利多卡因對睪丸進行局部麻醉。用一個23 號針頭與含有5% G-MOPS 培養(yǎng)基（Vitrolife）的5 mL 注射器相連，通過陰囊皮膚刺入睪丸以獲得足夠的睪丸組織。采集后，立即將睪丸組織放在一個裝滿HEPES-緩沖培養(yǎng)基（G-MOPS）的盤子里，并送至實驗室進行顯微鏡檢查。用無菌空針將獲得的睪丸組織碾碎，并在顯微鏡下（× 400）檢查懸浮液的精子形態(tài)質量和運動能力。

1.2.3 受精、胚胎評估和胚胎移植 獲取的卵母細胞采用睪丸精子常規(guī)行ICSI 受精和胚胎培養(yǎng)。觀察并記錄ICSI 后第3、5、6 天的胚胎受精、卵裂情況和囊胚形成情況。根據(jù)Gardner 囊胚分級系統(tǒng)選擇優(yōu)質囊胚進行新鮮周期移植或者FET。FET 患者采用人工周期方案準備內(nèi)膜，待內(nèi)膜厚度≥8 mm 時轉化內(nèi)膜，移植后繼續(xù)激素維持治療。

1.2.4 妊娠結局判斷 移植囊胚14 d 后測量血清β-HCG 以確定妊娠狀態(tài)。臨床妊娠被定義為移植后約4 周內(nèi)出現(xiàn)帶有卵黃囊的孕囊和胎心搏動?；町a(chǎn)被定義為妊娠≥24 周的活體嬰兒出生。出生體質量＜2 500 g 的嬰兒為低出生體質量。

1.3 評價指標 記錄并比較兩組基本臨床資料［男女年齡、不育年限、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）、催乳素（PRL）、雌二醇（E2）、睪酮（T）、AMH、BMI、扳機日子宮內(nèi)膜厚度］、妊娠結局（平均移植囊胚數(shù)、種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率）和新生兒情況（妊娠周數(shù)、新生兒體質量、低體質量新生兒發(fā)生率、出生性別比）。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有資料均采用軟件SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較 冷凍周期組女方平均年齡為（29.45 ± 5.08）歲，新鮮周期組女方平均年齡為（29.42 ± 4.75）歲；冷凍周期組男方平均年齡為（32.01 ± 5.69）歲，新鮮周期組男方平均年齡為（32.57 ± 5.93）歲，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組不孕年限、性激素、BMI 及扳機日子宮內(nèi)膜厚度比較差異也均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data in two groups ±s

表1 兩組患者的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data in two groups ±s

項目女性年齡（歲）男性年齡（歲）不育年限（年）女LH（IU/L）女FSH（IU/L）女PRL（ng/mL）女E2（pg/mL）女T（ng/mL）女AMH（ng/mL）男LH（IU/L）男FSH（IU/L）女BMI（kg/m2）男BMI（kg/m2）扳機日子宮內(nèi)膜厚度（mm）冷凍周期組（n=162）29.45±5.08 32.01±5.69 3.82±3.25 5.16±2.34 6.15±2.25 9.49±4.28 26.21±8.14 5.00±1.78 3.22±1.28 7.33±3.11 9.61±5.04 21.89±1.81 23.24±4.37 11.07±3.00新鮮周期組（n=178）29.42±4.75 32.57±5.93 3.88±3.10 5.06±2.29 6.55±2.24 9.14±4.42 26.69±7.86 5.05±1.75 3.51±1.58 7.99±3.62 9.12±4.70 21.95±1.76 23.80±3.66 10.98±2.81 t值0.064 0.832 0.175 0.378 1.527 0.697 0.514 0.248 1.802 1.703 0.867 0.302 1.176 0.287 P值0.949 0.406 0.861 0.706 0.128 0.486 0.608 0.804 0.073 0.090 0.387 0.763 0.241 0.775

2.2 兩組妊娠結局比較 在平均移植囊胚數(shù)相似的情況下，兩組的種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者的妊娠結局對比Tab.2 The comparison of pregnancy outcomes in two groups例（%）

2.3 兩組新生兒結局比較 截止隨訪，冷凍周期組有84 例新生兒出生，早產(chǎn)兒有13 例；新鮮周期組有102 例新生兒出生，早產(chǎn)兒有6 例。冷凍周期組的平均妊娠時間（gestation length）少于新鮮周期組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組的平均出生體質量、低體質量新生兒率和出生性別比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組新生兒結局比較Tab.3 The comparison of neonatal outcomes between the two groups ±s

表3 兩組新生兒結局比較Tab.3 The comparison of neonatal outcomes between the two groups ±s

結果妊娠周數(shù)新生兒體質量（g）低體質量新生兒發(fā)生率［例（%）］出生性別比［男（%）］冷凍周期組（n=84）37.99±2.30 2 992.77±594.67 13（15.5）42（50.0）新鮮周期組（n=102）38.61±1.29 3 128.13±536.01 13（12.8）48（47.1）χ2/t 值2.200 1.617 0.286 0.160 P 值0.030 0.108 0.593 0.690

3 討論

隨著胚胎冷凍解凍技術的發(fā)展和應用，F(xiàn)ET在輔助生殖中的比例不斷的提升，新鮮周期移植和FET 對妊娠結局的影響成為了輔助生殖領域關注的焦點。既往相關研究中男性配偶使用的多為射出精子，尚沒有使用睪丸精子的相關研究報道，由于睪丸精子與射出精子在功能成熟度等方面存在差異性，因此很有必要探討對于使用睪丸精子ICSI 后囊胚移植策略。本研究回顧性分析比較了使用睪丸精子進行ICSI 后新鮮和凍融囊胚移植妊娠結局和新生兒結局的差異性，本研究結果表明兩組在臨床妊娠率、早產(chǎn)率和活產(chǎn)率等方面無明顯差異，進一步研究新生兒結局發(fā)現(xiàn)，兩組的新生兒出生體質量也是類似的。

目前有較多研究報道了關于輔助生殖中凍融與新鮮胚胎移植對妊娠結局和新生兒的影響［11-14］，但對于兩種移植方式的優(yōu)缺點臨床上尚存有爭議。在體外受精中，移植新鮮胚胎通常比移植冷凍胚胎更受青睞，VUONG 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在接受試管嬰兒助孕的不孕婦女中，冷凍胚胎移植與新鮮移植相比，妊娠結局沒有明顯差異。潘丹等［16］回顧性分析比較了行試管嬰兒助孕的患者新鮮移植與第一次凍融胚胎移植的妊娠結局，發(fā)現(xiàn)新鮮周期移植的臨床妊娠率、活產(chǎn)率等與FET是相似的，從患者經(jīng)濟效益角度考慮，建議選擇新鮮周期移植。但是在另一項大型的多中心試驗中發(fā)現(xiàn)，對于行試管嬰兒助孕的患者來說，F(xiàn)ET 有較高的活產(chǎn)率，但是移植后發(fā)生子癇前期的風險更高［17］。習艷霞等［18］的研究與上述結果相似，認為FET 能夠獲得更高的妊娠率和更好的臨床結局。

上述相關研究納入的病例使用的精液來源均是男方射出精子，目前尚沒有文獻報道使用睪丸精子ICSI 助孕后的不同移植周期的妊娠結局差異。既往研究認為，睪丸精子與射出精子相比，在成熟度、核完整性、運動能力和形態(tài)等方面均存在差異性［19-21］。在本研究中，TESA 獲得的睪丸精子與射出精子相比數(shù)目更少，顯微鏡下檢查多為不動精子，少見活動精子，由于未經(jīng)附睪進一步發(fā)育，多表現(xiàn)為不成熟精子。不同來源的精子對試管嬰兒治療結局也造成了不同的影響，張志宏等［22］的研究發(fā)現(xiàn)睪丸精子經(jīng)ICSI 治療后正常受精率和優(yōu)質胚胎率均低于射出精子，這可能與睪丸精子成熟度低有關。因此有必要對經(jīng)睪丸精子ICSI 受精后的胚胎移植策略進行探討。本研究表明，對于除女方不育因素外的OA 患者來說，ICSI治療后囊胚FET 和新鮮移植的妊娠結局差異無統(tǒng)計學意義，雖然FET 組的平均妊娠時間（gestation length）較新鮮移植組略短，但兩組的新生兒結局包括早產(chǎn)率、平均出生體質量和低出生體質量率均沒有差異性。

對于行試管嬰兒助孕的患者夫婦來說，整個治療過程中生育壓力均會持續(xù)存在，而FET 會延長患者從助孕到獲得活產(chǎn)新生兒的時間，另外額外的冷凍復蘇費用會增加患者的經(jīng)濟成本。LE等［23］進行了一項非PCOS 患者FET 與新鮮周期移植的RCT 研究，并進行了成本效果分析，發(fā)現(xiàn)兩組的妊娠結局和平均治療成本是相似的（P＞0.05），但新鮮移植周期每一活產(chǎn)新生兒的成本是低于FET 組的。另外一方面冷凍復蘇技術對于胚胎的潛在影響也是FET 的不可忽視因素。因此本研究結果提示，對于使用睪丸精子進行試管嬰兒助孕的無精子癥患者臨床上應盡可能選擇新鮮移植。

本研究尚存在局限性，由于隨訪時間較短，因此新鮮移植或者FET 對于新生兒生長發(fā)育的長期影響還缺乏相關數(shù)據(jù)。另外本研究為回顧性分析，未來仍然需要大樣本隨機對照試驗（RCT）證據(jù)證明兩種不同移植策略對妊娠結局的影響。

綜上所述，對于梗阻性無精子癥患者，經(jīng)睪丸精子ICSI-ET 選擇新鮮或者冷凍周期囊胚移植對妊娠和新生兒結局沒有影響。但未來需要RCT 進一步的深入研究。