黃帥 黃國樑 令狐熙濤 謝尚延 瓦慶德 郭遠(yuǎn)清 黃彥

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科（廣州 510260）；2遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科（貴州遵義 563000）；3中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院脊柱外科（廣州 528406）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的以廣泛骨轉(zhuǎn)移為主要特征的惡性腫瘤之一，近年來我國PCa 發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢［1-2］。PCa患者一旦并發(fā)骨轉(zhuǎn)移后可引起高鈣血癥、病理性骨折和骨骼劇烈疼痛等多種并發(fā)癥［3-4］。PCa 的發(fā)生發(fā)展與腫瘤酸性微環(huán)境密切相關(guān)，PCa 細(xì)胞在生長與轉(zhuǎn)移過程中通過掠奪和優(yōu)先代謝營養(yǎng)物質(zhì)形成獨(dú)特的酸性微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)PCa 細(xì)胞的增殖、遷移及干細(xì)胞特性等［5-6］。因此，通過降低PCa細(xì)胞在酸性微環(huán)境中的生長和轉(zhuǎn)移特性，有望成為一種新的PCa 治療策略。樺木酸（betulinic acid，BA）是一種五環(huán)三萜類活性成分，具有顯著的抗瘤活性、調(diào)節(jié)免疫和抗氧化應(yīng)激等多種作用，能抑制黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移［8-9］。然而，BA 對PCa 骨轉(zhuǎn)移的潛在抑制作用尚未見報道。因此，本研究旨在探索BA 在酸性條件下對PC-3 細(xì)胞的增殖、遷移、干性及破骨細(xì)胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（美國Gibco 公司），樺木酸、MMP 抑制劑GM6001（美國Sigma 公司），重組人表皮生長因子EGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF、B27 添加物、胰島素（美國eBioscience公司），CD31、CD44、α-tublin、MMP-9、E-Cadherin 和RANKL 單克隆抗體（美國CST 公司），ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3 和RAW264.7 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，分別在含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基和DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境均為5% CO2、37 ℃。將微量HCL 和NaOH 溶液加入1640 培養(yǎng)基中并采用滴定法將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至7.4 和6.5 模擬酸性微環(huán)境。

1.2.2 CCK-8 試驗(yàn) 0.25%胰蛋白酶消化PC-3 細(xì)胞后用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為5×104個/mL 并接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入濃度為0、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L 樺木酸溶液，每組5 個復(fù)孔。24 h 后加入CCK-8 工作液10 μL，繼續(xù)孵育2 h 后通過酶標(biāo)儀檢測450 nm 處各孔吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 Transwell 試驗(yàn) 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L分別處理PC-3細(xì)胞，24 h 后胰酶消化重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1 × 106個/mL，然后將200 μL 細(xì)胞懸液接種于Transwell上室。并向下室分別加入含MMP 抗體（1∶800）、抑制劑GM6001（0.5 nmol/L）的1640 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，清除上室細(xì)胞，多聚甲醛固定30 min 后結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下拍照并隨機(jī)計(jì)數(shù)。

1.2.4 黏附試驗(yàn) 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分別處理6 孔板中PC-3 細(xì)胞。24 h 后胰酶消化重懸細(xì)胞密度至1× 106個/孔，將細(xì)胞懸液接種在FN 包被的96 孔板中，2 h 后用BSA 封閉30 min，PBS 清洗2 次后多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 成球試驗(yàn) 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細(xì)胞，然后用無血清1640 培養(yǎng)基（含20 ng/mL bFGF和EGF、1×B27）懸浮細(xì)胞至1 × 106個/mL，接種于培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)14 d 計(jì)數(shù)每孔腫瘤球數(shù)。

1.2.6 qPCR 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細(xì)胞，24 h 后提取細(xì)胞總RNA 并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA 文庫（樣品為2 μg）。使用實(shí)時PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共40 個循環(huán)。以GAPDH 作為對照，通過2-ΔΔCT法計(jì)算CD31、CD44 的mRNA 相對表達(dá)量?；蛞镄蛄腥缦拢篊D31：F 5′-ACATGGCAACAAGGCTGTGTA-3′、R 5′-CCTCAAACTGGGCATCATAAG-3′；CD44：F 5′-ACCCCAACTCCATCTGTGC-3′、R 5′-TTCTGGACATAGCGGGTG-3′；GAPDH：F 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、R 5′-GAAGATGGTG-ATGGGATTTC-3′。

1.2.7 Western blot 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分別處理PC-3 細(xì)胞，24 h 后提取總蛋白，BCA 法定量。按30 μg/孔將蛋白樣品加入凝膠中電泳120 min，然后電轉(zhuǎn)90 min，脫脂奶粉緩沖封閉2 h，洗滌后加入一抗稀釋液CD31（1∶1 000）、CD44（1∶1 000）和α-tublin（1∶1 000）4 ℃封閉過夜。室溫震蕩1 h 后加入相應(yīng)二抗（1∶2 000），洗膜40 min 后用ECL 試劑盒檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.8 破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)及酸性磷酸酶（TRAP）染色 首先在6 孔板中按pH 7.4 組、pH 6.5 組、pH 6.5+ BA 10 μmol/L 組、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 組處理細(xì)胞24 h，分別收集上清液后離心5 min，去渣后獲得條件培養(yǎng)基。然后將RAW264.7 細(xì)胞接種至6 孔板中，貼壁后分別與條件培養(yǎng)基和RANKL抗體（1∶1 000）共同孵育，7 d 后使用TRAP 試劑盒進(jìn)行染色。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用（）表示，統(tǒng)計(jì)分析和作圖使用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 軟件，采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BA 抑制PC-3 細(xì)胞增殖 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與中性pH 7.4（對照組）相比，pH 6.5 酸性微環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而不同濃度的BA 溶液以濃度依賴性抑制酸性微環(huán)境中PC-3 細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 BA 抑制PC-3 細(xì)胞在體外的增殖Fig.1 BA inhibited PC-3 cells proliferation in vitro

2.2 BA 抑制PC-3 細(xì)胞遷移 Transwell 試驗(yàn)結(jié)果顯示酸性微環(huán)境促進(jìn)PC-3 細(xì)胞的遷移能力，10 μmol/L 和15 μmol/L 的BA 溶液抑制PC-3 細(xì)胞的遷移能 力（P＜0.05），與MMP-9 抗體和抑制 劑GM6001 的抑制效應(yīng)一致（圖2）。

圖2 BA 抑制PC-3 細(xì)胞的遷移（×100）Fig.2 BA inhibited migration of PC-3 cells in vitro（×100）

2.3 BA 抑制PC-3 細(xì)胞黏附 基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性微環(huán)境能提高PC-3 細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附能力，分別在酸性微環(huán)境中添加10、15 μmol/L 濃度的BA 溶液和E-Cadherin 抗體后，PC-3 細(xì)胞的遷移能力顯著減弱（P＜0.05，圖3）。

圖3 BA 抑制PC-3 細(xì)胞的黏附（×100）Fig.3 BA inhibited the adhesion ability of PC-3 cells in vitro（×100）

2.4 BA 抑制PC-3 細(xì)胞干細(xì)胞特性 成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC-3細(xì)胞在酸性微環(huán)境中的成球能力增強(qiáng)，而10 μmol/L和15 μmol/L的BA則抑制PC-3細(xì)胞在酸性微環(huán)境中的成球能力（P＜0.05，圖4A-B）。同時BA 顯著下調(diào)PC-3 細(xì)胞中CD31、CD44 的表達(dá)水平（P＜0.05，圖4C-E）。

圖4 BA 抑制PC-3 細(xì)胞的干細(xì)胞特性（×100）Fig.4 BA inhibited the stem cell property of PC-3 cells in vitro（×100）

2.5 BA 抑制PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞成骨分化 破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性微環(huán)境能促進(jìn)PC-3細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨分化，添加10、15 μmol/L 的BA 溶液后，PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨分化作用顯著減弱（P＜0.05，圖5）。

圖5 BA 抑制PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成（×100）Fig.5 BA inhibited the PC-3 cells-induced osteoclastogenesis（×100）

3 討論

酸性微環(huán)境與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對PCa 的生長和骨轉(zhuǎn)移中起著重要作用［10-11］。前期研究中發(fā)現(xiàn)pH 6.5 的酸性微環(huán)境能增強(qiáng)PC-3 細(xì)胞的侵襲、干細(xì)胞特征［5］，因此在本研究中繼續(xù)用pH 6.5 的培養(yǎng)基作為酸性微環(huán)境模擬條件，以探索BA 在酸性微環(huán)境中對PC-3 細(xì)胞的影響。BA 是一種五環(huán)三萜類化合物，其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制自噬發(fā)揮抗瘤、抗炎和抗氧化活性［12-13］。SELVANATHAN 等［14］發(fā)現(xiàn)BA 可通過激活A(yù)MPK 信號抑制胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性和EMT 過程。HSIAO 等［15］發(fā)現(xiàn)BA 通過靶向NF-κB通路抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移。但BA在酸性微環(huán)境中對PCa 細(xì)胞生長與骨轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚，在本研究中首先通過CCK8 檢測了BA 對PC-3 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示pH 6.5酸性微環(huán)境能增強(qiáng)PC-3細(xì)胞的增殖，而BA 則呈濃度依賴性抑制PC-3 細(xì)胞的增殖，表明BA具有抑制PC-3細(xì)胞生長的活性。

遷移和黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移的兩個關(guān)鍵步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以通過水解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，E-cadherin蛋白則是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵跨膜糖蛋白［16］。EKANEM 等［17］和ZHANG 等［18］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MMP2 和MMP9 或下調(diào)MMP9 可抑制膠質(zhì)瘤、卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而E-cadherin的表達(dá)異常會改變前列腺癌、肺癌的轉(zhuǎn)移特性［19］。在本研究中分別采用了Transwell試驗(yàn)和黏附試驗(yàn)評估BA 在酸性微環(huán)境中對細(xì)胞遷移和黏附的影響，結(jié)果顯示酸性微環(huán)境促進(jìn)PC-3 細(xì)胞的遷移和黏附，而加入10、15 μmol/L 的BA 溶液則顯著抑制PC-3 細(xì)胞的遷移和黏附，其抑制效果與使用MMP 抗體、MMP 抑制劑GM6001 和E-cadherin 抗體阻斷MMP 與E-cadherin 一致，提示BA 溶液能通過抑制PC-3 細(xì)胞在酸性微環(huán)境中的遷移和黏附能力發(fā)揮抗PCa 轉(zhuǎn)移活性。前列腺癌干細(xì)胞對PCa 骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生起著關(guān)鍵作用，消除PCa干細(xì)胞是一種潛在的PCa治療策略［20］。本研究采用成球試驗(yàn)檢測BA 在酸性微環(huán)境中對PC-3 細(xì)胞成球能力的影響，結(jié)果表明pH 6.5 的酸性微環(huán)境促進(jìn)了PC-3 細(xì)胞的成球能力，而BA 抑制PC-3細(xì)胞的成球能力，同時BA 抑制干性標(biāo)記基因CD31、CD44 的表達(dá)，上述結(jié)果證實(shí)BA 能抑制酸性微環(huán)境中PC-3 細(xì)胞的干細(xì)胞特性。在PCa 骨轉(zhuǎn)移過程中，破骨細(xì)胞被異常激活并導(dǎo)致骨質(zhì)破壞從而誘發(fā)骨不良相關(guān)事件，而阻斷RANKL 分子則能抑制破骨細(xì)胞分化，從而改善PCa 骨轉(zhuǎn)移患者臨床癥狀。在成骨分化實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)RANKL 抗體對PC-3細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨分化與酸性微環(huán)境中BA溶液誘導(dǎo)結(jié)果一致，均能抑制PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨分化，提示BA是一種有效的破骨細(xì)胞生成抑制劑。

綜上所述，BA 可以抑制PC-3 細(xì)胞在酸性微環(huán)境中的增殖、遷移及干細(xì)胞特性，同時能顯著抑制PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，上述結(jié)果提示樺木酸可能是一種有效的抗PCa 骨轉(zhuǎn)移活性成分，為后續(xù)開發(fā)新型抗PCa 藥物提供了前期試驗(yàn)依據(jù)。但其有關(guān)的作用機(jī)制和體內(nèi)抑瘤效應(yīng)尚未探索和驗(yàn)證，下一步將在本研究結(jié)果基礎(chǔ)上更深入的研究BA發(fā)揮抗PCa作用的具體機(jī)制和體內(nèi)效果。