尹錦雯 朱海瑛 肖國宏

1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室（廣州 510150）；2廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州 511442）；3廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科（廣州 510260）

隨著社會經(jīng)濟和工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染如大氣污染、水環(huán)境污染、噪音污染、輻射等嚴重影響了女性生殖系統(tǒng)的功能，導致卵巢早衰甚至造成不孕不育，使得越來越多人的生育力降低［1-3］。先前有研究證明，環(huán)境污染物與生殖系統(tǒng)健康關系密切，例如：雙酚A［4-5］、百草枯［6-7］、赭曲霉毒素A 等［8-9］環(huán)境污染物影響斑馬魚、小鼠、牛和羊等卵子成熟，導致早期胚胎發(fā)育異常等。二苯酮-3（benzophenone-3，BP-3）是防曬霜的主要成分，能有效減少紫外線對人體的傷害，同時廣泛應用于洗發(fā)露、化妝品等個人護理用品中［10］。隨著人們防曬意識的加強，BP-3使用越來越多，已成為環(huán)境污染物，研究發(fā)現(xiàn)［11］，BP-3 在游泳池、湖泊、海水等水環(huán)境中都被檢測到，且在人體的尿液、血液、乳汁、胎盤中也檢測到BP-3。也有研究已經(jīng)證明［12-13］，BP-3 會影響哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，25 μmol/L BP-3會降低小鼠新皮質(zhì)細胞類視黃醇受體的表達，說明BP-3 具有神經(jīng)毒性。美國食品和藥物管理局（FDA）建議的閾值為2.2 nmol/L［14］，而BP-3 在人體血漿中的生理濃度為0.7 ～0.9 μmol/L。目前，BP-3對哺乳動物生殖系統(tǒng)的影響的報道較少。因此，探究生理濃度范圍內(nèi)BP-3 暴露對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟及其質(zhì)量的影響是有必要的，旨在為環(huán)境污染物對女性生殖系統(tǒng)的危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗所用小鼠為ICR品系，6 ～10周齡的雌性小鼠。本研究所用小鼠均購自廣東省動物實驗中心，所有實驗均獲得廣州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。醫(yī)院倫理批件號：醫(yī)倫會審［2020］第021號，審批時間2020-04-09。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑PMSG、HCG購自寧波第二激素廠，M2 培養(yǎng)液、M16 培養(yǎng)液、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司，BP-3 購自Selleck Chemicals 公 司，Annexin-V-FITC 購 自Life Technologies 公 司，一抗γ-H2AX 購于CST 公司，二抗購于Abcam 公司，RNA 提取試劑盒購自Qiagen 公司，熒光定量檢測試劑盒購自TaKaRa 公司。主要儀器包括尼康倒置熒光顯微鏡、Applied Biosystems ABI-7900 SDS 實時熒光定量PCR 儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵母細胞的收集和成熟培養(yǎng) 選取6～10周齡的雌性ICR 小鼠，每只小鼠腹腔注射5 IU 的PMSG 進行超排處理，48 h 后頸椎脫臼處死小鼠，取出GV 期卵子放入平衡后的M16 培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，17 h 后統(tǒng)計第一極體（PB1）排出情況。

1.2.2 卵母細胞的試驗處理 將BP-3 溶解于DMSO，以50 mmol/L的濃度分裝，-80 ℃保存。使用前用M16 培養(yǎng)液將BP-3 的濃度稀釋成2 nmol/L、25 nmol/L、0.25 μmol/L、0.8 μmol/L、1.5 μmol/L，簡稱BP-3 培養(yǎng)液。將采集的小鼠GV 期卵子，分別放入M16 培養(yǎng)液（對照組）及BP-3 培養(yǎng)液中，體外培養(yǎng)17 h 后統(tǒng)計PB1 排出情況。GV 期卵子體外培養(yǎng)結果顯示，BP-3 濃度為25 nmol/L、0.25 μmol/L、0.8 μmol/L、1.5 μmol/L 處理后的卵子PB1 排出率低于對照組（P＜0.05），見表1。BP-3濃度為2 nmol/L 時，卵子成熟率與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），BP-3 使用濃度越高卵子成熟率越低，說明小鼠卵子成熟與BP-3 呈劑量依賴性，見圖1。近期研究表明BP-3 在血漿中的生理濃度在0.7～0.9 μmol/L 之間［10，13］，因此本實驗BP-3 組采用的BP-3 處理濃度為0.8 μmol/L。

表1 不同濃度BP-3 處理對卵子體外成熟的影響Tab.1 Effects of different BP-3 concentrations on in vitro oocyte maturation ±s

表1 不同濃度BP-3 處理對卵子體外成熟的影響Tab.1 Effects of different BP-3 concentrations on in vitro oocyte maturation ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05

濃度0 2 nmol/L 25 nmol/L 0.25 μmol/L 0.8 μmol/L 1.5 μmol/L卵子數(shù)（個）174 171 177 179 195 162第一極體數(shù)（個）146 134 125 118 109 79第一極體排出率（%）84.35±6.89 77.39±10.17 70.40±9.23a 66.49±10.22a 55.42±12.20a 50.54±17.10a P 值0.109 0.004＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 BP-3 暴露影響小鼠卵母細胞體外成熟率Fig.1 BP-3 exposure affects in vitro maturation rate of mouse oocytes

1.2.3 卵母細胞的ROS、DNA 損傷和早期凋亡的測定 以DCHFDA為標記探針檢測卵子ROS含量，將100 μmol/L DCHFDA染料加入卵子中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，再用PBS 洗滌3 次，通過熒光顯微鏡觀察。使用ImageJ 軟件分析卵母細胞的熒光強度，熒光越強代表ROS 水平越高。

γ-H2AX 免疫熒光染色檢測DNA 損傷，用4%多聚甲醛固定成熟卵子30 min，1%Triton-X 透膜20 min，0.5%BSA 室溫封閉3 h，加入一抗γ-H2AX（1∶400）4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次，加入二抗IgG（1∶500）孵育1 h，PBS 洗滌3 次，加入DAPI（1∶800）孵育4 min 后，壓片后用熒光顯微鏡觀察。

采用Annexin-V-FITC 試劑盒檢測卵子凋亡，卵子加入Binding Buffer 洗滌5 min，然后加入490 μL 1×Binding Buffer 以及5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，用PBS 洗滌3 次后移至載玻片上，立即在熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.2.4 qRT-PCR 檢測mRNA 的表達 采用Qiagen RNeasy Mini Kit RNA 提取試劑盒提取總RNA，測定濃度后使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，按說明書配置好20 μL qRT-PCR 反應體系。預變性95 ℃30 s；變性95 ℃5 s；退火60 ℃30 s；延伸72 ℃1 min，循環(huán)40 次。引物序列如下：GAPDH：正 向5′-CAGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反 向5′-GTGGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′，產(chǎn)物長度為190 bp；Gpx1：正向5′-CCAGGAGAATGGCAAGAATGAA-3′，反 向5′-AGGAAGGTAAAGAGCGGGTGAG-3′，產(chǎn)物長度為138 bp；Sod1：正向5′-CACTCTCAGGAGAGCATTCCA-3′，反向5′- CCCAGCATTTCCAGTCTTTG-3′，產(chǎn)物長度為110 bp；Bax：正向5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′，反向5′-ATCCTCTGCAGCTCCATGTT-3′，產(chǎn)物長度為162 bp；Bcl2：正 向5′-TCGCTACCGTCGTGACTTCGC-3′ ，反 向5′-GCATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′，產(chǎn)物長度為273 bp。按照2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用方差分析。每個統(tǒng)計至少3 個生物學重復，每個重復是由一個獨立的試驗在不同的時間完成。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BP-3 對卵子ROS、DNA 損傷和早期凋亡的影響 免疫熒光結果顯示，BP-3 處理后的卵子ROS 水平升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2；BP-3 暴露的小鼠卵子γ-H2AX信號明顯強于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A、C，說明BP-3 暴露的卵子中DNA 雙鏈斷裂（DSBs）數(shù)量顯著提高。此外，通過Annexin-V 法檢測了卵子中早期凋亡情況，與對照組相比，BP-3 暴露組的小鼠卵子早期凋亡比例顯著增加（P＜0.05），見圖3A、B。

圖3 BP-3 暴露引起小鼠卵子早期凋亡和DNA 損傷Fig.3 BP-3 exposure induces early apoptosis and DNA damageof mouse oocytes

2.2 卵子中Gpx1、Sod1、Bax、Bcl2基因的轉錄水平 qRT-PCR 結果顯示，BP-3 暴露的卵子中Gpx1的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），對Sod1基因的表達沒有明顯變化（P＞0.05）。此外，與對照組相比，BP-3組明顯提高了Bax的表達水平，抑制了Bcl2的轉錄（P＜0.05），見圖4。

圖4 成熟卵子中氧化應激與凋亡相關基因的表達水平Fig.4 Expression levels of oxidative stress and apoptosisrelated genes in matured mouse oocytes

3 討論

隨著皮膚癌的發(fā)病率不斷提高，人們對皮膚癌的防護意識也越來越強，防曬霜的使用也隨之增加［15-16］。BP-3是一種紫外線吸收劑，常用于防曬霜中，可以有效保護皮膚免受紫外線傷害，同時也是一種新型的環(huán)境污染物，在許多水環(huán)境中被檢測出來，會影響魚類的孵化率和繁殖率、影響海膽骨架系統(tǒng)的發(fā)育、導致珊瑚白化、變形，甚至死亡［17-19］。研究發(fā)現(xiàn)，BP-3 能穿透角質(zhì)層直接接觸皮膚，被人體吸收，容易引起光過敏，甚至還會影響內(nèi)分泌和雌激素水平［2］。但目前，BP-3 對哺乳動物卵子成熟和胚胎發(fā)育的影響的研究較少。因此，本研究選擇小鼠作為研究對象，探討B(tài)P-3 的生理濃度是否會對卵子成熟及質(zhì)量造成影響是本次實驗的目的。

PB1 的排出標志著第一次減數(shù)分裂的完成，是卵子成熟的重要標志物。本次研究通過將小鼠卵子暴露在不同濃度的BP-3 中，觀察不同濃度的BP-3 對小鼠卵子成熟的影響。實驗結果表明，2 nmol/L BP-3 處理組的卵子PB1 排出率與對照組相比沒有顯著差異，說明在FDA 的安全建議量范圍內(nèi)BP-3對卵子的成熟發(fā)育無影響。但是，與對照組卵子相比，25 nmol/L、0.25、0.8、1.5 μmol/L BP-3處理均降低了卵子體外成熟水平，且BP-3的濃度與PB1排出率呈負相關（P＜0.05）。BP-3 在血漿中的生理濃度為0.7 ～0.9 μmol/L，說明生理濃度BP-3暴露會導致小鼠卵子成熟率下降。

卵子體外培養(yǎng)因暴露在光和高濃度氧的環(huán)境中，容易產(chǎn)生大量的ROS，發(fā)生氧化應激，有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激會損傷線粒體蛋白質(zhì)和DNA，從而介導細胞凋亡［20-21］。研究結果證明，0.8 μmol/L BP-3 暴露明顯提高了卵子的ROS 水平且抗氧化基因Gpx1的表達下調(diào)（P＜0.05），這與黃倩倩［20］、MOMTAHAN 等［21］的研究結果相似。

Bcl2和Bax是重要的凋亡相關基因，Bcl2 表達過量能夠阻止細胞色素C 從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，從而抑制細胞凋亡［22］。而Bax過表達時則會拮抗Bcl2的保護作用，促進細胞凋亡［23］。γ-H2AX是DNA 雙鏈斷裂的標志物，當DSBs 發(fā)生時H2AX會被磷酸化形成γ-H2AX［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，BP-3 處理降低了卵子中Bcl2基因表達，上調(diào)了Bax 基因轉錄，提高了γ-H2AX 的表達水平（P＜0.05），說明BP-3 處理會引起小鼠卵子發(fā)生早期凋亡，加劇DNA 損傷，這與先前的研究結果一致［24-26］。以上結果表明生理濃度BP-3 暴露可能會導致卵子早期凋亡及其質(zhì)量下降。

綜上所述，BP-3 是常見的環(huán)境污染物，生理濃度范圍內(nèi)BP-3 暴露會破壞卵子胞內(nèi)氧化還原平衡，引起DNA 損傷和早期凋亡，最終導致卵子體外成熟水平顯著降低。同時本研究仍存在一些局限性：體外實驗初步證明了BP-3 對小鼠卵子發(fā)育的影響，但體內(nèi)環(huán)境與體外存在差異，需結合體內(nèi)實驗作進一步評估；有關減數(shù)分裂過程中染色體的排列、紡錘體的形態(tài)以及對卵母細胞線粒體質(zhì)量的影響也有待進一步的研究。然而，BP-3 在生活用品中的廣泛使用是否會對人類卵子和胚胎發(fā)育造成影響目前尚未清楚，在今后的研究中需要結合臨床試驗，以全面評估BP-3 的生物安全性及其可能帶來的生殖危害。本研究為BP-3 對女性生殖系統(tǒng)存在的潛在危害提供了初步的實驗依據(jù)。