陳曼 夏汝斌 林虹 李志凌

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（廣東汕頭 515041）

近年來(lái)輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）快速發(fā)展，但反復(fù)種植失敗（repeated implantationfailure，RIF）的發(fā)生率高達(dá)5%～10%［1］，成為影響輔助生殖技術(shù)成功率的重要制約因素之一。RIF 的原因復(fù)雜且涉及多個(gè)方面，子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥）可導(dǎo)致胚胎種植率下降［2］，也是導(dǎo)致RIF 的因素之一，因而，對(duì)于發(fā)生RIF 的內(nèi)異癥患者，如何改善內(nèi)膜容受性是獲得理想妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)外研究［3-4］多認(rèn)為IVF-ET 前使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）預(yù)處理有助于提高內(nèi)異癥患者的臨床妊娠率，那么，對(duì)于RIF 的內(nèi)異癥患者，凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，TET）前采用GnRH-a 預(yù)處理是否可以提高子宮內(nèi)膜容受性、改善臨床結(jié)局，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本文回顧性分析了本院近5年內(nèi)異癥患者TET 相關(guān)資料，旨在探索RIF 的內(nèi)異癥患者的可能影響因素及最佳治療方案，以幫助患者盡快獲得臨床妊娠。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2016-2020年在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受凍融胚胎移植治療的81 周期內(nèi)異癥相關(guān)不孕患者的臨床資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合病史、體征及輔助檢查（影像學(xué)檢查及血清CA125）臨床診斷或手術(shù)診斷為內(nèi)異癥；年齡＜40 歲；胚胎移植次數(shù)≥3 次。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）子宮發(fā)育異常（如雙子宮、雙角子宮、單角子宮、子宮中隔等）、甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥等；（2）夫婦雙方任意一方染色體異常；（3）既往不良孕史：自然流產(chǎn)史（≥2）、死產(chǎn)史、死胎史、胎兒畸形史等；（4）年齡≥40 歲。符合以上剔除指標(biāo)任一條則不入選該研究。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 研究方法 胚胎凍融患者的控制性超促排卵（controlled-ovarian stimulation，COS）周期中，根據(jù)患者年齡、不孕因素及卵巢儲(chǔ)備情況，選用不同的COS 方案，當(dāng)2 ～3 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm，平均每成熟卵泡E2水平為200 ～300 pg/mL 時(shí)，當(dāng)日白天繼續(xù)或停止促性腺激素，當(dāng)晚注射絨促性素（human chorionic gonadotropin，hCG，麗珠）5 000～10 000 IU 或重組人絨促性素（recombinant hCG，r-hCG，默克雪蘭諾）250 μg，36 ～38 h 后取卵；對(duì)于拮抗劑方案促排者，如果出現(xiàn)多個(gè)卵泡發(fā)育，有OHSS 高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，采用短效GnRH-a（醋酸曲普瑞林，益普生）0.1 ～0.2 mg，或GnRH-a 0.1 mg 聯(lián)合小劑量hCG 誘導(dǎo)卵泡成熟，扳機(jī)后34 ～36 h 后取卵，取卵后根據(jù)患者情況進(jìn)行IVF/ICSI。取卵后第3天或第5 天視情況（COS 方案、OHSS 風(fēng)險(xiǎn)、內(nèi)膜情況等）行胚胎移植或全胚冷凍。常規(guī)冷凍4 ～6 枚卵裂期胚胎，優(yōu)先冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，本研究中所有囊胚均為非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎來(lái)源。胚胎采用玻璃化冷凍法，試劑盒及冷凍載桿（日本加藤公司）使用方法按說明書進(jìn)行，胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2 h。

1.3 根據(jù)內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分組 臨床上根據(jù)患者病史、既往移植周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、剩余冷凍胚胎質(zhì)量、子宮大小及CA125 水平選擇不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。根據(jù)內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的不同，分為4 組，比較各組患者平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、平均移植次數(shù)、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率、多胎率及異位妊娠率等。

1.3.1 自然周期組（NC組）月經(jīng)第10-11天開始進(jìn)行B超監(jiān)測(cè)卵泡及內(nèi)膜，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑＞13 mm時(shí)，監(jiān)測(cè)尿黃體生成素（LH）q6～8 h，尿LH 陽(yáng)性則抽血檢測(cè)LH、雌二醇（E2）和孕酮（P）水平，當(dāng)血LH ＞20 mIU/mL，認(rèn)為出現(xiàn)血LH 峰，予注射r-hCG 250 μg/hCG 6 000 ～10 000 IU，以血LH 峰出現(xiàn)當(dāng)天為0 d，選擇胚胎移植的時(shí)間，若解凍D3 冷凍的胚胎，則在血LH 峰+4 d 進(jìn)行凍融胚胎移植，若解凍D5/6 冷凍的囊胚，則于血LH 峰+6 d 進(jìn)行凍融囊胚移植。排卵后給予地屈孕酮（達(dá)芙通，10 mg，荷蘭Abbott Biologicals B.V.）進(jìn)行黃體支持10 mg/次，2 ～3 次/d，至驗(yàn)孕日。

1.3.2 誘發(fā)排卵組（OI 組）月經(jīng)第2- 5 天開始口服來(lái)曲唑片（芙瑞，江蘇恒瑞醫(yī)藥），根據(jù)患者的年齡、體質(zhì)指數(shù)、卵巢儲(chǔ)備功能評(píng)估及卵巢反應(yīng)，必要時(shí)添加尿促性素（HMG，寧波人健藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司），B 超監(jiān)測(cè)卵泡及內(nèi)膜、誘發(fā)排卵、排卵后胚胎移植時(shí)間及黃體支持方案同NC 組。

1.3.3 激素替代組（HRT 組）月經(jīng)第2- 5 天開始口服雌激素，采用遞增方案，雌激素起始劑量為2 ～4 mg/d，4 ～7 d 后根據(jù)血E2水平及內(nèi)膜厚度、類型及生長(zhǎng)速度，必要時(shí)調(diào)整劑量，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm、血E2≥100 ～200 pg/mL 時(shí)，加孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜：口服地屈孕酮20 ～40 mg/d，和（或）陰道用雪諾酮90 mg/d（默克雪蘭諾），和（或）肌注黃體酮20 ～40 mg/d，若解凍D3 冷凍的胚胎，于內(nèi)膜轉(zhuǎn)化的第3 天行凍融胚胎移植，若解凍D5/6 冷凍的囊胚，則于第5 天行凍融囊胚移植。移植后繼續(xù)維持雌激素及孕激素，如宮內(nèi)妊娠，孕9 周開始逐漸減量至孕12 周停藥。

1.3.4 降調(diào)后激素替代組（降調(diào)HRT 組） 于月經(jīng)第2- 5 天予注射長(zhǎng)效GnRH-a（醋酸曲普瑞林，益普生）3.75 mg，4周后檢測(cè)血LH ≤5 mIU/mL，F(xiàn)SH ≤5 mIU/mL，E2≤50 pg/mL，P≤1 ng/mL，子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm 時(shí)開始雌激素遞增方案，激素補(bǔ)充、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化、胚胎移植時(shí)間及黃體支持方案同HRT 組。

1.4 根據(jù)進(jìn)行IVF 助孕治療前是否經(jīng)過手術(shù)治療分組 分為內(nèi)異癥術(shù)前組和內(nèi)異癥術(shù)后組，比較兩組臨床妊娠率。

妊娠判斷：胚胎移植14 d（囊胚移植后12 d），測(cè)定血β-hCG，如β-hCG ＜50 mIU/mL，停黃體支持藥物，1 周后復(fù)查β-hCG，同時(shí)密切觀察腹痛及陰道出血情況，不適隨診；如β-hCG ≥50 mIU/mL，確定為生化妊娠，繼續(xù)給予黃體支持；并于2 d 后、1 周后（必要時(shí)）查血清β-hCG 上升情況。胚胎移植后4 ～5 周左右行第1 次B 超檢查檢查胎兒數(shù)、胎心搏動(dòng)及胚胎著床部位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用二分類logistic 回歸分析影響臨床妊娠率的相關(guān)因素；樣本計(jì)量資料間的比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齊性，采用LSD 法進(jìn)一步行兩兩比較，若方差不齊，采用Dunnett′s T3 法；計(jì)數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床妊娠結(jié)局的影響因素分析 通過二分類logistic 回歸分析顯示，移植胚胎數(shù)及移植胚胎類型是影響臨床妊娠結(jié)局的因素（P＜0.05），而年齡、BMI、指征、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、轉(zhuǎn)化日E2水平、轉(zhuǎn)化日P 水平、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度及移植胚胎類型并不是影響臨床妊娠率的影響因素（P＞0.05，表1）。對(duì)移植胚胎數(shù)進(jìn)行ROC 曲線分析得出移植胚胎數(shù)的曲線下面積為0.586，cut off 值為2.5 枚（圖1）。進(jìn)行IVF/ICSI 助孕治療前是否經(jīng)過手術(shù)治療的臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 內(nèi)異癥術(shù)前組及術(shù)后組兩組間臨床妊娠率的比較Tab.2 Comparison of the clinical pregnancy rate between the preoperative and postoperative groups of endometriosis

圖1 移植胚胎數(shù)的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of the number of embryo transferred

表1 影響RIF 的內(nèi)異癥相關(guān)不孕患者臨床妊娠結(jié)局的二分類logistic 分析Tab.1 Logistic analysis of factors Affecting clinical pregnancy outcomes in infertility patients with endometriosis and RIF

2.2 不同胚胎質(zhì)量胚胎種植率的比較 根據(jù)移植胚胎質(zhì)量比較胚胎著床率，結(jié)果見圖2，移植囊胚的胚胎著床率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。

圖2 不同胚胎質(zhì)量胚胎著床率的比較Fig.2 Comparison of embryo implantation rate with different embryo quality

2.3 不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案組患者一般情況及妊娠結(jié)局的比較 OI 組僅2 個(gè)周期行凍融胚胎移植，均未獲得臨床妊娠，因例數(shù)過少不納入組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3）：三組間的平均年齡、移植次數(shù)、內(nèi)膜厚度等患者基線資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HRT 組的平均移植胚胎數(shù)較NC 組明顯增加（P＜0.05），而臨床妊娠率及胚胎種植率高于NC 組及降調(diào)HRT 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組間的多胎率、早期流產(chǎn)率及異位妊娠率等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)移植胚胎類型不同，分別比較三組間的優(yōu)胚率及臨床妊娠率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案組間患者一般情況及臨床結(jié)局的比較Tab.3 Comparison of patients′general situation and clinical outcome between different endometrial preparation groups

3 討論

反復(fù)種植失敗是目前輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，但關(guān)于RIF 的定義目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的是：40 歲以下的女性，經(jīng)歷3 次以上胚胎移植周期，且累積移植至少4 枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎或者3 枚優(yōu)質(zhì)囊胚而未能獲得臨床妊娠［5］。胚胎種植的分子機(jī)制尚未闡明，其原因復(fù)雜且涉及多個(gè)方面，其中包括了兩個(gè)關(guān)鍵因素：胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性及兩者的相互作用，對(duì)于RIF 患者而言，在多次移植優(yōu)質(zhì)胚胎失敗后，如何提高子宮內(nèi)膜容受性則成為提高臨床妊娠率的關(guān)鍵，因此，選擇合適的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案尤其重要。目前TET 的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案主要包括自然周期、促排卵周期、激素替代周期或降調(diào)激素替代周期。NC方案子宮內(nèi)膜的發(fā)育由內(nèi)源性激素調(diào)控，更符合生理狀態(tài)，但監(jiān)測(cè)頻繁、不能靈活安排時(shí)間。OI 方案主要作為不適宜使用HRT 方案的排卵障礙患者的備選方案。HRT 和降調(diào)HRT 方案通過周期使用外源性雌、孕激素，調(diào)控子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，具有復(fù)診少、工作計(jì)劃性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在患者對(duì)外源性激素反應(yīng)不良、用藥量大、用藥時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)［6］。臨床上常根據(jù)患者病史、不孕因素、既往移植周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、剩余冷凍胚胎質(zhì)量等選擇不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。對(duì)內(nèi)異癥患者，我科傾向于首選降調(diào)HRT 方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備。主要是因?yàn)镚nRH-a 可下調(diào)垂體功能，促性腺激素的分泌下降，抑制卵巢活性，降低雌激素的分泌，降低盆腔微環(huán)境炎性因子水平，而內(nèi)異癥為雌激素依賴性疾病，GnRH-a 通過抑制卵巢功能使內(nèi)異灶萎縮，提高內(nèi)膜容受性，有利于卵泡發(fā)育及胚胎種植，從而成為臨床上內(nèi)異癥藥物治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果也顯示［7-8］GnRH-a 預(yù)處理組可提高子宮腺肌?。ú辉校┗颊邇鋈谂咛ヒ浦驳娜焉锝Y(jié)局，國(guó)內(nèi)專家意見［9］也認(rèn)為GnRH-a 預(yù)處理可以使內(nèi)異癥不孕患者在接受IVF治療時(shí)受益。而對(duì)RIF患者，也有研究［10-11］認(rèn)為GnRH-a 預(yù)處理可改善RIF患者凍融胚胎移植的臨床妊娠率和胚胎著床率，但目前尚存在爭(zhēng)議。當(dāng)內(nèi)異癥不孕患者在IVF 治療過程發(fā)生RIF，治療難度將大幅增加，成為臨床醫(yī)師面臨的極為棘手的問題。考慮GnRH-a 在內(nèi)異癥治療的優(yōu)勢(shì)及RIF 的可能受益作用，采用降調(diào)HRT 方案較其他內(nèi)膜準(zhǔn)備方案能否改善臨床結(jié)局，目前國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。

在蘇瓊等［12］的研究中，凍融卵裂期胚胎移植和凍融囊胚移植的兩組患者在降調(diào)激素替代組和激素替代組之間的臨床結(jié)局差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DAVAR 等［13］比較RIF 患者TET 周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，亦發(fā)現(xiàn)降調(diào)HRT 組與HRT 組的臨床妊娠率與胚胎種植率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過比較各內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的患者一般資料及臨床治療結(jié)局，發(fā)現(xiàn)無(wú)論移植卵裂期胚胎還是囊胚期胚胎，降調(diào)HRT 并不能提高RIF 的內(nèi)異癥患者TET 周期的臨床妊娠率及胚胎種植率，結(jié)果與上述作者觀點(diǎn)一致。在本研究中，HRT 組的臨床妊娠率和胚胎種植率較其他兩組有升高的趨勢(shì)，可能原因：（1）本研究對(duì)象為RIF 的子宮內(nèi)膜異位癥患者，樣本數(shù)偏少，需要更大樣本進(jìn)一步證實(shí)；（2）雖然本研究中HRT 組卵裂期胚胎的優(yōu)胚率低于NC 組和降調(diào)HRT 組，但移植胚胎數(shù)高于NC 組，結(jié)合logistic 回歸分析結(jié)果，移植胚胎數(shù)的增加可能是HRT組妊娠結(jié)局提高的原因之一。雖然在輔助生殖助孕過程中減少移植胚胎數(shù)目是降低多胎妊娠的最有效措施，但對(duì)于RIF 的內(nèi)異癥患者，可根據(jù)患者病情個(gè)體化調(diào)整移植策略，必要時(shí)適當(dāng)增加移植胚胎數(shù)目以提高臨床妊娠率。

在RIF 患者中，移植胚胎質(zhì)量也是另一個(gè)需要關(guān)注的重點(diǎn)，本研究通過logistic 回歸分析篩選出移植胚胎類型為影響RIF 的內(nèi)異癥患者TET 臨床妊娠結(jié)局的影響因素之一，并且NC 組、HRT 組和降調(diào)HRT 組的早期流產(chǎn)率分別為25.0%、0 和30.8%，總體早期流產(chǎn)率偏高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究中的卵裂期胚胎優(yōu)胚率不高、囊胚均來(lái)自非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。周敏等［14］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者行IVF/ICSI 受精率及優(yōu)胚率降低且流產(chǎn)率升高，提示內(nèi)異癥可影響胚胎質(zhì)量，與本研究結(jié)果一致。BOYNUKALIN 等［15］認(rèn)為內(nèi)異癥主要影響了胚胎早期形態(tài)動(dòng)力學(xué)事件及細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間，進(jìn)一步揭示了內(nèi)異癥影響胚胎質(zhì)量的機(jī)制。本研究中優(yōu)胚率偏低，也不排除與前期多次移植、優(yōu)質(zhì)胚胎消耗有關(guān)。盡管如此，本研究中囊胚的種植率仍顯著高于卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎，而不同質(zhì)量卵裂期胚胎組合的胚胎種植率無(wú)顯著性差異。張慶等［16］研究結(jié)果亦提示卵裂期胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)對(duì)臨床妊娠率及活產(chǎn)率等妊娠結(jié)局的影響不大，提示對(duì)于卵裂期非優(yōu)質(zhì)胚胎可進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，最終形成的囊胚具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)于行IVF 的EMS 患者，IVF 前是否手術(shù)是生殖醫(yī)生非常關(guān)注的問題?；仡櫺匝芯孔C實(shí)IVF 前完整切除異位病灶能明顯提高胚胎種植率、妊娠率及活產(chǎn)率［17］。IVF 前剝除卵巢子宮內(nèi)膜囊腫能夠預(yù)防囊腫破裂，有利于取卵，避免卵泡液污染，阻止疾病進(jìn)展，且能排除惡性可能［18］，但手術(shù)有損傷風(fēng)險(xiǎn)、存在并發(fā)癥、增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、可能降低卵巢反應(yīng)性、且目前尚無(wú)證據(jù)證實(shí)IVF 前手術(shù)可以提高妊娠率［19］。研究結(jié)果顯示IVF/ICSI 前是否經(jīng)過手術(shù)治療對(duì)內(nèi)異癥患者TET 的臨床結(jié)局沒有影響，雖然手術(shù)可消除內(nèi)異癥病灶、解除粘連，但一項(xiàng)回顧性病例對(duì)照研究［20］發(fā)現(xiàn)，與輸卵管因素不育的患者相比，EMS 并不影響IVF 的結(jié)局；腹腔鏡切除內(nèi)異癥病灶后也并不改善IVF 的結(jié)局。另有研究［21］顯示，對(duì)于EMS，無(wú)論是手術(shù)治療（囊腫剔除或穿刺）、藥物治療、手術(shù)及藥物聯(lián)合治療，還是保守觀察，都不影響ART 的臨床妊娠率。

綜上所述，移植胚胎數(shù)及移植胚胎類型是RIF的內(nèi)異癥患者行凍融胚胎移植結(jié)局的影響因素，不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案臨床妊娠結(jié)局相當(dāng)。RIF 的內(nèi)異癥患者TET 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的選擇應(yīng)根據(jù)既往內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及患者的臨床特點(diǎn)等因素綜合考慮，必要時(shí)可適當(dāng)增加移植胚胎數(shù)目或選擇移植囊胚以提高臨床妊娠率。但由于本研究屬于回顧性研究，且樣本量少，還需在今后的工作中進(jìn)行大樣本量的前瞻性深入研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。