許 軼 徐旭東

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

藍(lán)藻(藍(lán)細(xì)菌)是一類進(jìn)行放氧光合作用的原核生物, 可利用太陽光能固定CO2, 并利用碳、氮、磷和硫等無機(jī)營養(yǎng)合成生命活動(dòng)所需要的各種有機(jī)分子。一些藍(lán)藻種類可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng), 并具備遺傳操作系統(tǒng), 適合于合成生物學(xué)改造[1]。在合成生物學(xué)的研究中, 基因組簡(jiǎn)化是底盤生物構(gòu)建的一個(gè)重要方面。通過簡(jiǎn)化基因組刪除掉在人工培養(yǎng)條件下不需要的基因, 包括響應(yīng)環(huán)境變化和各類脅迫的復(fù)雜系統(tǒng)[2]。藍(lán)藻底盤生物的構(gòu)建同樣需要對(duì)基因組開展系統(tǒng)的刪除和改造。

目前大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌等模式生物均有基因組簡(jiǎn)化的報(bào)道。譬如, 有人構(gòu)建了基因組簡(jiǎn)化22.2%的大腸桿菌MGF-01, 與野生型菌株相比其生長(zhǎng)和蘇氨酸產(chǎn)量都有所提高[3]; 還有人構(gòu)建了基因組簡(jiǎn)化20.7%的枯草芽孢桿菌MBG874,其纖維素酶和蛋白激酶的產(chǎn)量較野生型均獲得提高[4]。由此可見, 通過適當(dāng)?shù)幕蚪M簡(jiǎn)化, 微生物可表現(xiàn)出更好的生產(chǎn)特性, 成為合成生物學(xué)理想的底盤細(xì)胞。但是也有研究表明, 基因組簡(jiǎn)化可導(dǎo)致生長(zhǎng)速率減緩, 對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力變?nèi)? 遺傳穩(wěn)定性變差。譬如, 有人通過同源重組和P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得基因組簡(jiǎn)化29.7%的大腸桿菌Δ16, 與野生型相比生長(zhǎng)減慢, 細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度發(fā)生改變, 胞內(nèi)核酸定位異常[5]。還有人獲得基因組刪減達(dá)23.5%的枯草芽孢桿菌MG1M, 其生長(zhǎng)速率、細(xì)胞形態(tài)和重組蛋白產(chǎn)量等性狀均不穩(wěn)定[6]。因此, 對(duì)基因組不適當(dāng)?shù)膭h減也可能對(duì)生長(zhǎng)、代謝及后續(xù)遺傳改造產(chǎn)生不利影響。

本實(shí)驗(yàn)室利用DNA同源重組和基于RNA介導(dǎo)的DNA剪切篩選對(duì)聚球藻PCC 7942基因組開展了系統(tǒng)的刪除, 得到了一系列大片段非必需區(qū)域刪除的突變株。在BG11培養(yǎng)條件下, 這些突變株與野生型在生長(zhǎng)上無差異, 但測(cè)試不同脅迫條件時(shí)發(fā)現(xiàn), 鹽度對(duì)某些突變株有顯著影響。其中將基因組區(qū)域Synpcc7942_0233-0253和Synpcc 7942_2169-2187分別敲除得到的突變株, 在BG11+0.4 mol/L NaCl培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)被抑制, 與野生型差異顯著。比較聚球藻PCC 7942和這兩個(gè)突變株在鹽脅迫下的光合電子傳遞鏈和呼吸活性的差異, 結(jié)果顯示, 這兩個(gè)區(qū)域很可能存在適應(yīng)脅迫所需要的基因。然而, 這些區(qū)域的刪除并不妨礙在非脅迫條件下的生長(zhǎng), 是有利于合成生物學(xué)目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942, 由中國科學(xué)院青島生物能源所呂雪峰實(shí)驗(yàn)室提供。野生型與突變株均在30℃、30 μE/(m2·s)連續(xù)光照下于BG11中靜置或旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為90 r/min),測(cè)試鹽脅迫效應(yīng)時(shí)加0.4 mol/L NaCl。通過測(cè)定培養(yǎng)物在730 nm的光密度(OD730)來監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線是3個(gè)平行培養(yǎng)的測(cè)試結(jié)果。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR反應(yīng)總體積為20 μL, 其中含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3), 50 mmol/L (NH4)2SO4, 2.5 mmol/L MgCl2, 50 μmol/L dNTPs, 引物各100 pmol(引物序列見表 1), DNA模板50 ng, 1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)。反應(yīng)先經(jīng)過94℃預(yù)變性6min, 之后為30個(gè)循環(huán)(94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 2min), 最后在72℃再反應(yīng)7min。

表1 本研究中所用到的引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 藻細(xì)胞掃描吸收光譜

取適量野生型和突變株藻液, 在4000 r/min離心3min收集后重懸于新鮮培養(yǎng)液, 調(diào)整OD730到相同水平, 再用UV-1601分光光度計(jì)(Shimadzu)在400—800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸收光譜。分別用BG11和添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基作空白對(duì)照, 比色皿的毛玻璃面朝向光源。

1.4 聚球藻PCC 7942總膜的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[7]所述方法制備聚球藻PCC 7942的總膜。離心收集50 mL藻液, 重懸于1 mL的磷酸鉀緩沖液(20 mmol/L, pH 7.8)。再加入適量的直徑為0.17 mm左右的玻璃珠(Sigma), 在漩渦振蕩器振蕩1min, 然后置于冰上1min, 重復(fù)此步驟5次。先后在4000 r/min、6000 r/min 離心10min, 收集上清, 再以35000 r/min超速離心收集總膜, 重懸于2 mL 10 mmol/L NaHCO3(pH 7.0)溶液。

1.5 光合放氧、呼吸耗氧速率的測(cè)定

按Gao和Xu描述的方法[7], 具體操作如下: 離心收集2 mL藻細(xì)胞(A730=0.5), 重懸于含10 mmol/L NaHCO3的25 mmol/L HEPES(pH 7.0), 先在黑暗條件下用Oxy-Lab氧電極(Hansatech)在30℃條件下測(cè)定藻細(xì)胞的呼吸耗氧速率, 每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間為5min左右; 打開光源, 光強(qiáng)800 μmol/(m2·s), 測(cè)定藻細(xì)胞的放氧速率。

利用全細(xì)胞測(cè)量PSII電子傳遞鏈的活性, 在細(xì)胞懸浮液中加入1 mmol/L K3Fe(CN)6和0.5 μmol/L DCBQ(2,6-dichloro-p-benzoquinone), 測(cè)定放氧速率。利用總膜測(cè)定PSI電子傳遞鏈活性, 在2 mL總膜懸浮液中加入10 μmol/L DCMU[3-(3,4-dichlorophenyl)-l, l-dimethyl urea], 1 mmol/L 抗壞血酸鈉, l mmol/L MV(methyl viologen)和l μmol/L DCPIP(2,6-dichlorophenol-indophenol), 測(cè)定耗氧速率。

光合放氧速率/呼吸耗氧速率 [μmol O2/(mg Chl.a)·h]=(斜率×60000)/(13.34×A664)。式中,13.34×A664為葉綠素a含量, 是葉綠素的甲醇提取液在664 nm處的光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 突變株的檢測(cè)驗(yàn)證

ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187是基因組非必需區(qū)域Synpcc7942_0233-0253(18 kb)和Synpcc7942_2169-2187(14 kb)分別被刪除的聚球藻PCC 7942突變株(基因組系統(tǒng)刪除和簡(jiǎn)化過程將另文發(fā)表)。由于藍(lán)藻基因組在細(xì)胞中存在多拷貝, 我們利用PCR檢測(cè)確認(rèn)突變株中是否仍殘留部分野生型。如圖 1所示, 引物對(duì)0233-0253-F′/R′在基因組中相距20.0 kb, 2169-2187-F′/R′相距16.2 kb, 均位于刪除區(qū)域之外, 而0233-0253-2和2169-2187-2位于刪除區(qū)域內(nèi)。對(duì)野生型和突變株進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如圖 2所示。以引物0233-0253-F′/R′或2169-2187- F′/R′進(jìn)行PCR檢測(cè), 突變株可擴(kuò)增出約2.1 kb的條帶, 說明已刪除該區(qū)域。以普通PCR檢測(cè)并不能檢測(cè)出野生型的20 或16.2 kb條帶, 所以我們還用引物0233-0253-F′/2和2169-2187- F′/2進(jìn)行PCR, 如果擴(kuò)增出1.1或者1.2 kb的條帶, 則說明存在野生型拷貝, 但是擴(kuò)增結(jié)果證明并沒有野生型拷貝, 說明突變株確實(shí)是完全分離的。

圖1 兩個(gè)缺失突變檢測(cè)引物在基因組上位置的示意圖Fig. 1 Schematic diagrams showing genomic positions of the primers for detection of deletions

圖2 兩個(gè)突變株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 PCR examination of 2 mutants

2.2 鹽脅迫下生長(zhǎng)的差異

比較突變株ΔSynpcc7942_0233-0253、ΔSynpcc7942_2169-2187與野生型在不同條件下的生長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)在BG11中沒有顯著差異或僅有微小差異(圖 3A),但在BG11+0.4 mol/L NaCl中, 突變株的生長(zhǎng)相對(duì)于野生型被嚴(yán)重抑制了(圖 3B)。

圖3 鹽脅迫對(duì)聚球藻PCC 7942及突變株生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of salt stress on the growth of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants

在0和96h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)掃描藻細(xì)胞吸收光譜, 將各樣品在730 nm處調(diào)成一致(調(diào)整濁度使生物量一致), 結(jié)果顯示: 在0時(shí)突變株與野生型差異較小(圖 4A),而在鹽脅迫96h后, 突變株的葉綠素(440和680 nm)、藻膽素(630 nm)、類胡蘿卜素(480—490 nm肩峰)吸收峰均明顯低于野生型(圖 4B)。

圖4 聚球藻PCC 7942及突變株以0.4 mol/L NaCl處理0 (A)和96h (B)的整細(xì)胞掃描吸收光譜Fig. 4 The whole cell scanning absorption spectra of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants at 0 (A) and 96h (B) after exposure to 0.4 mol/L NaCl

2.3 光合電子傳遞和呼吸活性的分析

進(jìn)一步檢測(cè)鹽脅迫對(duì)突變株光合放氧速率的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型和突變株總體都呈下降趨勢(shì),但2個(gè)突變株下降得更快, 96h后分別是野生型的41%和51%(圖 5)。

圖5 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中光合放氧速率Fig. 5 Oxygen evolution rates of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

同時(shí)測(cè)定突變株與野生型的呼吸速率, 發(fā)現(xiàn)在24h內(nèi)呼吸耗氧都明顯升高, 隨后野生型逐步降低,而突變株在48h后降低, 至96h仍維持較高水平(圖 6)。

圖6 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中呼吸耗氧速率Fig. 6 Respiratory rates of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

為進(jìn)一步闡釋鹽脅迫對(duì)光合活性的影響, 本研究測(cè)量了光系統(tǒng)(PS)Ⅰ和Ⅱ的電子傳遞速率。在鹽脅迫96h后, 野生型PSⅡ電子傳遞反應(yīng)速率下降了52%, 而ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187分別下降了77%和82%(圖 7); 野生型PSⅠ電子傳遞速率下降了32%, 而ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187分別下降了50%和47%(圖 8)。

圖7 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中PSⅡ電子傳遞反應(yīng)速率Fig. 7 Rates of PSⅡ electron transfer reactions of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

圖8 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中PSI電子傳遞鏈反應(yīng)速率Fig. 8 Rates of PSI electron transfer reactions of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

3 討論

聚球藻PCC 7942有望發(fā)展成為燃料與高價(jià)值化學(xué)品的生產(chǎn)平臺(tái)[8], 其基因組中的必需基因與非必需基因已有系統(tǒng)的鑒定[9]。針對(duì)非必需基因區(qū)域開展基因組簡(jiǎn)化可以使其遺傳背景簡(jiǎn)單化, 提升合成生物學(xué)操作的可預(yù)測(cè)性和可控制性。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其大片段非必需區(qū)域開展系統(tǒng)刪除, 并在不同溫度、光強(qiáng)和鹽脅迫等條件下檢查突變株適應(yīng)能力的變化, 發(fā)現(xiàn)少數(shù)區(qū)域的刪除導(dǎo)致耐鹽脅迫能力的降低。

鹽脅迫是最常見的非生物脅迫之一, 通過離子脅迫和滲透脅迫改變代謝過程和光合作用[10]。此外, 鹽脅迫會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量[11]。在鹽脅迫下細(xì)胞產(chǎn)生的ROS抑制轉(zhuǎn)錄因子活性[12],抑制D1蛋白以及其他光系統(tǒng)相關(guān)蛋白的合成, 甚至破壞類囊體膜結(jié)構(gòu), 使光合作用受阻[13]。聚球藻PCC 7942維持穩(wěn)定生長(zhǎng)能耐受NaCl的最高濃度約為0.4 mol/L[14], 而在此濃度的NaCl脅迫下, Synpcc 7942_0233-0253和Synpcc7942_2169-2187區(qū)域刪除突變株的生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制。整細(xì)胞掃描吸收光譜還顯示, 突變株在鹽脅迫下各種色素吸收峰比野生型降低, 可能與光合復(fù)合體、藻膽體等結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。在鹽脅迫下, 2個(gè)突變株的光合放氧活性均比野生型下降得更快; 進(jìn)一步測(cè)定野生型和突變株P(guān)SⅡ和PSⅠ的電子傳遞速率, 觀察到突變株的PSⅡ和PSⅠ都受到更顯著的損害, 尤以PSⅡ更加敏感。實(shí)際上, 在更高濃度的NaCl脅迫下(0.5 mol/L), 聚球藻的PSⅡ和PSⅠ均失活[15], 這與本研究觀察到的情況相映證。與光合作用相反, 在鹽脅迫下突變株的呼吸活性比野生型維持在更高水平。這種情況尚未在文獻(xiàn)中有類似報(bào)道, 值得進(jìn)一步研究。光合作用活性比野生型降低, 而呼吸活性比野生型高, 兩相疊加導(dǎo)致突變株在鹽脅迫下合成少、消耗多, 生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。

聚球藻PCC 7942耐受NaCl脅迫主要依賴于蔗糖合成和Na+泵出維持胞內(nèi)滲透壓平衡。蔗糖的合成涉及基因Synpcc7942_0808, 其產(chǎn)物具有蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖磷酸酶(SPP)結(jié)構(gòu)域[16]。Na+的泵出主要是借助于Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Antiporter)和Na+/K+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17], 其中涉及編碼Na+/H+泵的有6個(gè)基因, 即napA、nha4、nha1、nha2、nha3和nha6。在突變株ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187缺失的區(qū)域中并沒有這些基因, 但有預(yù)測(cè)編碼Na+/Ca2+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因Synpcc7942_0242, 還有預(yù)測(cè)為Na+/H+交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因nha7(Synpcc7942_2186)[18,19]。這些基因是否參與耐鹽生理效應(yīng), 有待實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。

基因組簡(jiǎn)化既可能提高合成生物學(xué)底盤生物的生理和生產(chǎn)性狀, 也可能帶來某些不利影響。因此, 在藍(lán)藻基因組簡(jiǎn)化的過程中需要保持對(duì)生長(zhǎng)特性、生理適應(yīng)性和遺傳穩(wěn)定性的監(jiān)測(cè)。本研究報(bào)道了兩個(gè)非必需基因區(qū)域的刪除導(dǎo)致耐鹽能力降低, 但并不妨礙在非脅迫條件下的生長(zhǎng)。這些信息的掌握對(duì)于底盤生物基因組的設(shè)計(jì)和未來生產(chǎn)條件的控制都是需要的。