譚祿奇 周 楊 王苗苗 楊承忠, 趙元莙*

(1. 重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶市動物生物學(xué)重點實驗室, 重慶 401331; 2. 銅仁學(xué)院, 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室, 銅仁 554300)

黏孢子蟲是一類物種豐富、分布廣泛的后生動物寄生蟲, 主要寄生于魚類, 迄今已報道的種類約有2600種[1]。早期對于黏孢子蟲的分類主要依據(jù)成熟孢子的形態(tài)特征, 但因黏孢子蟲個體微小、形態(tài)簡單、可用于分類的形態(tài)學(xué)特征較少, 許多分類學(xué)問題無法得到解決, 形態(tài)相似種的鑒別尤其困難。近幾十年來, 分子生物學(xué)的應(yīng)用, 極大程度地促進了黏孢子蟲分類學(xué)的發(fā)展, 解決了諸多經(jīng)典分類學(xué)的遺留問題[2—6]。目前, 綜合利用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等信息進行黏孢子蟲分類學(xué)的研究已成為該領(lǐng)域?qū)W者們的共識。

葡萄碘泡蟲Myxobolus acinosusNie & Li,1973、似葡萄碘泡蟲Myxobolus pseudoacinosusGuo,et al., 2018和茄形碘泡蟲Myxobolus toyamaiKudo, 1917均寄生于鯉科魚類的鰓絲部, 且形態(tài)非常相似, 在病原鑒定中容易混淆。葡萄碘泡蟲由倪達書和李連祥于1973年在采自湖北省黃石市花馬湖的鯉Cyprinus carpio的鰓絲上檢獲并命名[7], 后來又有學(xué)者分別在采自湖北省孝感市的鯉、湖北省武昌市的鏡鯉、浙江省靈江市的鯉及武陵山地區(qū)(湖南省吉首市、貴州省銅仁市)的鯽Carassius auratus auratus的鰓絲上獲得該種[8]。似葡萄碘泡蟲由Guo等[9]于2018年在采自湖北省武漢市的鯉的鰓絲上檢獲并命名。茄形碘泡蟲由Kudo于1917年在鯉的鰓上檢獲并命名。據(jù)原始描述, 該種含有一個極囊及位于該極囊前端的一個長條狀原生質(zhì)團[10]。1933年, Kudo建立了單極蟲屬ThelohanellusKudo,1933, 并將茄形碘泡蟲置于該屬中[11]。然而, 多年來, 該物種孢子中的長條狀原生質(zhì)團是否為極囊一直備受爭議, 因此茄形碘泡蟲M.toyamai和茄形單極蟲T.toyamai這兩個物種名的有效性受到質(zhì)疑[12—14]。2015年, Yokoyama等[15]發(fā)現(xiàn)上述長條狀原生質(zhì)團其實是一個小型極囊, 據(jù)此重新確認了物種名茄形碘泡蟲M. toyamai的有效性。茄形碘泡蟲分布廣泛, 在蘇聯(lián)、美國、越南北部、歐洲、日本和中國等均有發(fā)現(xiàn)[8,14—16]。本實驗在我國境內(nèi)再次獲得了葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲, 基于形態(tài)學(xué)和18S rRNA基因信息對三者進行鑒別和分子系統(tǒng)學(xué)研究, 以期更深入地了解這三個物種間的進化關(guān)系, 為魚類病原的鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與物種鑒定

宿主鯉分別于2019年7月、2019年9月和2020年8月采自重慶市沙坪壩區(qū)和大足區(qū)及貴州省銅仁市碧江區(qū)。在被感染的宿主鰓絲部可以觀察到乳白色的圓形和橢圓形孢囊, 參考趙元莙等[17]的方法進行后續(xù)樣品的處理及基于形態(tài)學(xué)的物種鑒定。

1.2 主成分分析方法

基于成熟孢子的孢子長、孢子寬、大極囊長、大極囊寬、小極囊長和小極囊寬的測量值, 利用PAST3進行主成分分析(PCA), 以分析葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲不同株系及不同物種間的形態(tài)差異。使用變量協(xié)變矩陣生成具有95.0%置信的散點圖。

1.3 DNA提取與PCR擴增

將獲得的葡萄碘泡蟲孢囊戳破后立即挑取部分孢子鏡檢, 顯微拍照, 剩下的孢子用無水乙醇浸泡在離心管中保存。從裝有樣品的離心管底部吸取10 μL含有黏孢子蟲的液體, 經(jīng)超純水清洗2—3次以除去雜質(zhì), 再用Dneasy Tissue Kit (QIAGEN, Germany)試劑盒按照廠家提供的說明書進行基因組DNA的提取。提取得到的40 μL基因組DNA溶液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用于擴增18S rDNA基因的引物為18e(5′-CTGGTTGATCCTGC CAGT-3′)[18]和18R(5′-CTACGGAAACCTTGTT ACG-3′)[19]。25 μL的PCR反應(yīng)體系: 超純水6.5 μL,模板DNA 4 μL, Mix 12.5 μL, 10 μmol/L引物各1 μL。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性90s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 35個循環(huán); 最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離, 用DNA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)進行純化回收, 將回收產(chǎn)物插入pMD18-T載體(TaKaRa, 日本), 導(dǎo)入大腸桿菌進行單克隆培養(yǎng), 每株系送兩個克隆子至英濰捷基(上海)生物公司測序, 得到每株系測序返回的兩個克隆子18S rDNA序列相同。

1.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育

序列相似度的計算用在線序列雙重比對工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa)完成。所選序列兩兩之間的遺傳距離利用MEGA 6.0[20]選擇K2P模型計算完成。變異位點分析借助Bioedit和MEGA 6.0完成。將本實驗獲得的4條葡萄碘泡蟲18S rDNA序列、1條似葡萄碘泡蟲18S rDNA序列和2條茄形碘泡蟲18S rDNA序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進行序列同源比對。根據(jù)比對結(jié)果, 選取與這7條序列同源性較高的67條序列, 加上本實驗得到的7條序列, 另選取鮭兩極蟲Myxidium truttaeAF201374、金色楚克拉蟲Zschokkella auratisKC84942作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用MrBayes 3.1.2軟件[21]構(gòu)建BI樹, 序列最佳進化模型為GTR+I+G, 共執(zhí)行10000000代, 每200代抽樣1次,在舍棄25%的老化樣本后, 根據(jù)剩余樣本構(gòu)建一致樹。利用在線軟件CIPRES Science Gateway V. 3.1(htlp://www.phylo.org/sub_sections/portal)構(gòu)建ML樹, 選用模式為RAxML-HPC2 XSEDE(8.2.12)。然后用FigTree v 1.3.1和Photoshop CS3完成系統(tǒng)樹的繪制。

1.5 18S rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)模型從歐洲核糖體RNA數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.Psb.ugent.Be/webtools/rRNA/s ecmodel/index.html)[22]獲得。利用MEGA 6.0對所選18S rRNA基因進行比對以獲得可變序列區(qū)域, 基于18S rRNA二級結(jié)構(gòu)對進化趨勢進行比較研究。用軟件RNA Structure 5.3采用自由能最小化模型[22,23]對二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測, 所有參數(shù)均設(shè)置為默認值。獲得的二級結(jié)構(gòu)與已知的真核生物18S rRNA二級結(jié)構(gòu)模型進行比較, 并使用RNAViz 2.0手動調(diào)整[24,25]。

2 結(jié)果

2.1 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲的形態(tài)學(xué)描述

本實驗共獲得葡萄碘泡蟲4個株系, 均寄生于鯉的鰓絲部, 其中株系1(S1)采自重慶沙坪壩區(qū), 另3株系采自貴州銅仁碧江區(qū)(S2、S3和S4; 表 1)。4株系孢囊均呈乳白色, 圓形, 直徑為0.1—0.3 mm(圖 1A)。成熟孢子殼面觀呈長葡萄形, 前端稍窄略彎, 后端圓鈍(圖 2A和2B), 孢子長(10.8±0.4) μm(9.3—11.9 μm;n=120), 孢子寬(6.2±0.4) μm (5.0—7.1 μm;n=120)。兩極囊位于孢子前端, 形態(tài)和大小差異較大, 大極囊呈梨形, 長(4.6±0.5) μm (3.1—5.4 μm;n=120), 寬(2.6±0.3) μm (1.8—3.2 μm;n=120), 極絲纏繞5—6圈; 小極囊呈球棒形, 長(2.3±0.3) μm(1.7—2.9 μm;n=120), 寬(0.9±0.1) μm (0.7—1.3 μm;n=120), 極絲纏繞2—3圈?？p面觀呈透鏡形, 縫脊較粗(圖 2C和2D)。4株系形態(tài)與《中國動物志》[8]報道株系(S5)及原始報道株系(S6)一致(表 1)。主成分分析顯示, 本實驗獲得的葡萄碘泡蟲4株系間形態(tài)學(xué)量度無顯著差異(圖 3)。

圖1 葡萄碘泡蟲孢囊(A)和茄形碘泡蟲孢囊(B)Fig. 1 Cysts of M. acinosus (A) and M. toyamai (B)

表1 葡萄碘泡蟲各株系形態(tài)比較Tab. 1 The morphological comparison among different strains of Myxobolus acinosus

本實驗獲得似葡萄碘泡蟲1個株系, 采自重慶大足區(qū), 寄生于鯉的鰓絲部, 孢囊呈乳白色, 橢圓形。似葡萄碘泡蟲成熟孢子殼面觀呈茄形, 前端狹窄且彎曲, 后端圓鈍, 孢子長(15.9±0.5) μm (15.1.8—17.0 μm;n=30), 寬(5.5±0.5) μm (5.0—6.3 μm;n=30)。兩極囊位于孢子前端, 形態(tài)和大小差異較大, 大極囊呈梨形, 長(7.7±0.5) μm (6.7—8.7μm;n=30), 寬(3.5±0.3) μm (3.0—4.1 μm;n=30), 極絲纏繞7—8圈, 小極囊呈球棒形, 長(3.2±0.2) μm (2.5—3.5 μm;n=30), 寬(0.9±0.1) μm (0.7—1.0 μm;n=30),極絲纏繞2—3圈(圖 2E和F)。未觀察到縫面觀。本實驗所得似葡萄碘泡蟲株系(S1)形態(tài)與原始報道的寬型株系(S3)一致(表 2)。

本實驗獲得茄形碘泡蟲2個株系(S1和S2), 均采自貴州銅仁碧江區(qū), 寄生于鯉的鰓絲部, 孢囊呈乳白色, 圓形, 直徑為0.2—0.5 mm(圖 1B), 成熟孢子殼面觀呈茄形, 前端狹窄稍彎, 后端圓鈍, 孢子長(15.3±0.6) μm (14.3—16.6 μm;n=60), 寬(6.2±0.4) μm(5.0—7.0 μm;n=60)。兩極囊位于孢子前端, 形態(tài)和大小差異較大, 大極囊呈梨形, 長(5.6±0.4) μm(4.6—6.4 μm;n=60), 寬(2.9±0.2) μm (2.4—3.4 μm;n=60), 極絲纏繞6—8圈。小極囊呈球棒形, 長(3.0±0.3) μm (2.2—3.7 μm;n=60), 寬(0.9±0.1) μm(0.6—1.2 μm;n=60), 極絲纏繞2—3圈(圖 2G和2H)。孢子縫面觀似梨形, 前端狹窄彎曲, 后端圓鈍(圖 2I和2J)。本研究所得茄形碘泡蟲形態(tài)與原始報道株系一致(表 2)。主成分分析顯示, 本實驗獲得的茄形碘泡蟲2株系間形態(tài)量度無顯著差異(圖 3)。

表2 似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲株系形態(tài)比較Tab. 2 The morphological comparison among different strains of Myxobolus pseudoacinosus and Myxobolus toyamai

圖2 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲成熟孢子形態(tài)圖Fig. 2 Mature spores of M. acinosus, M. pseudoacinosus and M. toyamai

圖3 基于葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析圖Fig. 3 Principal component analysis based on morphological data of M. acinosus, M. pseudoacinosus and M. toyamai

2.2 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲18S rRNA基因分析

獲得葡萄碘泡蟲S1—S4株系18S rDNA序列長度分別為1986 nt(GenBank登錄號: MW821466)、1899 nt(GenBank登錄號: MW821467)、1896 nt(GenBank登錄號: MW821468)和1903 nt(Gen-Bank登錄號: MW821469)。4株系間序列相似度為100%, 遺傳距離為0.000—0.001, 變異位點有0—1個。4株系18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的葡萄碘泡蟲(KX810022、KX810021)的相似度最高(99.9%—100%)。6條序列之間相似度為99.9%—100%,遺傳距離為0.000—0.002, 變異位點有0—2個(圖 4)。

獲得似葡萄碘泡蟲18S rDNA序列1條, 序列長度1897 nt(GenBank登錄號: MW821470), 與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的似葡萄碘泡蟲(KX586684和KX810019)相似度最高(99.8%), 三條序列的相似度為99.6%—99.8%, 遺傳距離為0.002—0.007, 變異位點有4—8個(圖 4)。

獲得茄形碘泡蟲S1和S2株系18S rDNA序列長度分別為1641 nt(GenBank登錄號: MW821471)和1758 nt(GenBank登錄號: MW821472), 兩株系序列相似度為100%, 遺傳距離為0.000, 變異位點0個。兩株系與GenBank數(shù)據(jù)庫中的茄形碘泡蟲(LC010116、C010115、FJ710802和HQ338729)相似度最高(99.5%—100%), 6條序列之間相似度為99.5%—100%,遺傳距離為0.000—0.003, 變異位點有0—3個(圖 4)。

葡萄碘泡蟲與似葡萄碘泡蟲之間的18S rDNA相似度為98.4—98.8%, 遺傳距離為0.013—0.020,變異位點有23—26個; 葡萄碘泡蟲與茄形碘泡蟲18S rDNA序列相似度為96.1—97.2%, 遺傳距離為0.038—0.042, 變異位點有55—58個; 似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲18S rDNA序列相似度為96.4—97.6%,遺傳距離為0.033—0.040, 變異位點有46—63個(圖 4)。

圖4 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲18S rDNA的變異位點Fig. 4 The variable sites of 18S rDNA among M. acinosus, M. pseudoacinosus and M. toyamai

本文對葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲的18S rRNA二級結(jié)構(gòu)中的V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8 和V9等9個可變區(qū)進行了分析, 結(jié)果顯示V4區(qū)的E23-2構(gòu)型可將葡萄碘泡蟲與似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲有效地區(qū)分開: 與似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲相比較, 葡萄碘泡蟲E23-2的發(fā)卡環(huán)更大(8堿基vs.11堿基), 且在發(fā)卡環(huán)旁邊少一個單堿基(A堿基)側(cè)凸(圖 5)。同時, V7區(qū)的H43構(gòu)型可以將茄形碘泡蟲分別與葡萄碘泡蟲和似葡萄碘泡蟲有效區(qū)分: 與葡萄碘泡蟲和似葡萄碘泡蟲相比較, 茄形碘泡蟲H43的內(nèi)部環(huán)更大(9堿基vs.10堿基), 而發(fā)夾環(huán)更小(7堿基vs.6堿基)。

圖5 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲的18S rRNA二級結(jié)構(gòu)的E23-2 和 H43構(gòu)型Fig. 5 The model of E23-2 and H43 of secondary structure of 18S rRNA among M. acinosus, M. pseudoacinosus and M. toyamai

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

基于18S rDNA構(gòu)建的BI和ML樹呈現(xiàn)相似的拓撲結(jié)構(gòu)(圖 6)。系統(tǒng)發(fā)育樹首先分為兩大進化支(Clade A和Clade B, 圖 6), 葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲為A進化支中分化較晚的一支。雖然葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲有些種內(nèi)株系間的系統(tǒng)關(guān)系在ML樹和BI樹中不一致, 但兩系統(tǒng)樹均支持葡萄碘泡蟲各株系聚為一支, 似葡萄碘泡蟲各株系聚為一支, 茄形碘泡蟲各株系聚為一支。在亞支Ⅰ中(Subclade I, 圖 6), 似葡萄碘泡蟲位于基部位置, 葡萄碘泡蟲與長孢碘泡蟲形成姐妹群關(guān)系, 茄形碘泡蟲與擬茄形碘泡蟲(GenBank登錄號: LC228237)形成姐妹群關(guān)系。

圖6 基于18S rDNA序列構(gòu)建的ML/BI樹Fig. 6 Phylogenetic trees generated by ML/BI methods based on 18S rDNA sequences

3 討論

葡萄碘泡蟲、似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲有著共同的宿主(鯉)和寄生部位(鰓), 成熟孢子均前端較尖后端圓鈍, 均具一大一小極囊, 在鑒定中容易混淆, 但三者形態(tài)仍有細微差別: 葡萄碘泡蟲孢子為長葡萄形, 可與孢子呈茄形的似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲區(qū)分; 與茄形碘泡蟲相比, 似葡萄碘泡蟲孢子更細長且其大極囊在孢子腔內(nèi)的占比更大(圖 2)。另外, 主成分分析顯示, 三者形態(tài)量度存在顯著差異(圖 3)。雖然學(xué)者們普遍認為物種鑒定的遺傳學(xué)閾值并不存在, 但基于18S rDNA, 有學(xué)者認為大多數(shù)黏孢子蟲的種內(nèi)相似度范圍應(yīng)為99.0%—100%[26], 冉佼等[27]認為種內(nèi)遺傳距離范圍大多數(shù)集中在0.000—0.007, Zhao等[28]認為種內(nèi)變異位點應(yīng)少于10個。葡萄碘泡蟲與似葡萄碘泡蟲的18S rDNA相似度為98.4—98.8%, 遺傳距離為0.013—0.020, 變異位點有23—26個, 超出上述種內(nèi)范圍, 兩者應(yīng)為種間水平。類似的, 葡萄碘泡蟲與茄形碘泡蟲及似葡萄碘泡蟲與茄形碘泡蟲也應(yīng)屬于種間水平。另外, 18S rRNA二級結(jié)構(gòu)V4區(qū)的E23-2構(gòu)型可將葡萄碘泡蟲分別與似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲區(qū)分, 而V7區(qū)的H43構(gòu)型可將該蟲與葡萄碘泡蟲和似葡萄碘泡蟲區(qū)分(圖 5)。同時, 通過18S rDNA序列比對發(fā)現(xiàn), 葡萄碘泡蟲含有15個關(guān)鍵變異位點可將該蟲與似葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲區(qū)分; 似葡萄碘泡蟲含有5個關(guān)鍵變異位點可將該蟲與葡萄碘泡蟲和茄形碘泡蟲區(qū)分; 茄形碘泡蟲含有33個關(guān)鍵變異位點可將該蟲與葡萄碘泡蟲和似葡萄碘泡蟲區(qū)分(圖 4)。綜上表明三者無論在形態(tài)上還是遺傳上均具有獨立物種的特征。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 黏孢子蟲成熟孢子的形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切, 如A進化支(Clade A)中大部分物種孢子形態(tài)為梨形, 前端稍尖, 后端圓鈍; 進化支B(Clade B)中大多數(shù)物種孢子形態(tài)為圓形或橢圓形, 前端和后端都較圓鈍(圖 6)。但仍有一些黏孢子蟲的形態(tài)并不完全符合該規(guī)律, 如A支中圣安德烈碘泡蟲Myxobolus szentendrensisCech,et al.,2015, 鰓側(cè)碘泡蟲Myxobolus branchilateralisMolnár,et al., 2012, 肥滿碘泡蟲Myxobolus obesusGurley, 1893, 埃拉斯碘泡蟲Myxobolus eirasianusCech,et al., 2012, 射陽碘泡蟲Myxobolus sheyangensisLiu,et al., 2016, 塔形碘泡蟲Myxobolus pyramidisChen, 1958, 墜形碘泡蟲Myxobolus pendulaGuilford, 1967, 卡拉瓦提碘泡蟲Myxobolus kalavatiaeSzékely,et al., 2015 和內(nèi)膜碘泡蟲Myxobolus intimusZaika, 1965的孢子形態(tài)更接近B支中圓形或橢圓形孢子形態(tài)(圖 6)。在B支中, 中華單極蟲Thelohanellus sinensisChen & Hsieh, 1960和龜鱉單極蟲Thelohanellus testudineusLiu,et al, 2014的孢子形態(tài)更接近A支中的梨形孢子形態(tài)(圖 6)。

以往的研究和本文都表明, 黏孢子蟲的系統(tǒng)發(fā)育與宿主類群關(guān)系密切: 相同分類階元(如目、科)的宿主寄生的黏孢子蟲之間有著較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[29—32], 如本文系統(tǒng)發(fā)育樹中的黏孢子蟲均寄生于鯉形目鯉科魚類。在寄生蟲與宿主的關(guān)系中,宿主轉(zhuǎn)移是人們普遍關(guān)注的問題之一, 一些寄生蟲通過探索新的宿主來促進自身對環(huán)境的適應(yīng)。宿主轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致寄生蟲宿主范圍的擴大或者放棄原來的宿主, 這是在系統(tǒng)發(fā)育樹中處在同一支系且親緣關(guān)系較近的寄生蟲對應(yīng)的宿主親緣關(guān)系卻較遠的首要原因[33]。如本文系統(tǒng)發(fā)育樹中的穆勒碘泡蟲Myxobolus muelleriBütschli, 1882除了感染鯉形目鯉科魚類, 還能感染鱸形目杜父魚科魚類和鯔形目鯔科魚類。另外, 中華單極蟲除了感染鯉形目鯉科魚類, 還能感染鱸形目鱧科魚類、鱸形目蝦虎科魚類及鰻形目鰻科魚類。通過黏孢子蟲的系統(tǒng)發(fā)育與宿主類群關(guān)系的分析推測, 穆勒碘泡蟲和中華單極蟲的原始宿主應(yīng)為鯉科魚類, 其他類群應(yīng)是這兩種黏孢子蟲通過宿主轉(zhuǎn)移方式獲得的新宿主類群, 從而擴大了寄生蟲的宿主范圍。