周雨欣 何玉英, 李 健, 魏 威, 王 瓊, 謝擁軍

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266235; 4. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 青島 266237;5. 河北省水產(chǎn)良種與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測保護總站, 石家莊 050000)

鹽度的變化能影響生物體的正?；顒? 是能影響水生甲殼動物正常發(fā)育的一種非常重要的生態(tài)因子[1—3]。大量降水導(dǎo)致池塘水鹽度改變造成水生甲殼動物體內(nèi)滲透壓失衡, 引起一系列生理適應(yīng)性反應(yīng)[4,5]。暴雨造成的池塘鹽度急劇變化往往會導(dǎo)致中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)機體免疫力下降[6]。Spanings-Pierrot等[7]研究發(fā)現(xiàn)多巴胺在維持滲透壓平衡中發(fā)揮一定作用; 潘魯青等[8]發(fā)現(xiàn)低鹽對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)鰓絲Na+-K+-ATPase活力有一定影響, 鹽度越低酶活力越大;高鹽脅迫對中國對蝦的生長存活無顯著影響[9—11];馬金武等[12]發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在急性鹽度脅迫下具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力,但未見有關(guān)中國對蝦在急性低鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)變化的研究。

鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(Guanine nucleotide binding protein, Gs)是一種重要的信號傳導(dǎo)分子, 可通過直接調(diào)節(jié)離子通道、激活第二信使等方式參與細胞信號傳導(dǎo)。多巴胺(DA)屬于生物胺的一種,是一種信號分子, 能夠參與甲殼動物體內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運過程[7]。Na+-K+-ATPase是一種調(diào)節(jié)滲透壓的非常重要的酶[13,14]。當(dāng)水生甲殼動物受到急性低鹽脅迫時, Na+-K+-ATPase能通過調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運對滲透壓調(diào)節(jié)過程發(fā)揮重要作用[15—18]。Neufeld等[19]和Savage等[20]認為生物胺能夠短期調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase活力。環(huán)境鹽度急劇變化時, 生物胺合成酶產(chǎn)生DA, 通過Gs傳導(dǎo)信號, 激活A(yù)C將ATP轉(zhuǎn)化成cAMP, cAMP與PKA相耦聯(lián), 通過PKA激活Na+-K+-ATPase, 進行滲透調(diào)節(jié)[21,22]。Lucu等[23]在對雜色瘦方蟹(Leptograpsus variegatus)的研究中發(fā)現(xiàn)將DA或cAMP注射到體內(nèi)能激活Na+-K+-ATPase。在三疣梭子蟹中研究發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫下DA與 Na+-K+-ATPase變化趨勢一致[5]。

本文通過探究急性低鹽脅迫下Gs基因在中國對蝦中的表達情況以及cAMP信號通路內(nèi)多個指標(biāo)的變化情況, 探討低鹽脅迫下Gs基因參與中國對蝦滲透壓調(diào)節(jié)機制, 為解析中國對蝦在低鹽脅迫下的環(huán)境適應(yīng)性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物均取自日照開航水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司,隨機選用平均體長為(11.59±0.96) cm, 平均體重為(21.29±2.47) g的活力好且規(guī)格整齊的中國對蝦, 在實驗用水泥池中暫養(yǎng)7d, 暫養(yǎng)期間保證每天換水清污, 24h充氧泵連續(xù)充氧, 按時投喂。實驗用水為凈化后的海水, 水溫為(20—22)℃, 鹽度為26—28,pH為8.14—8.20。

1.2 實驗方法

總RNA的提取及cDNA的合成挑選活力好的中國對蝦, 每3尾為一組, 分別取鰓、肝胰腺、眼柄、肌肉、胃、心臟和腸道樣品, 共取3組, 迅速放入液氮中保存。組織處理使用全自動樣品快速研磨儀(凈信, 上海), 樣品總RNA的提取使用TRI-zol up試劑, 檢測RNA的質(zhì)量和濃度使用NanoDrop 2000核酸定量儀(Tnermo, 美國), 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊, 南京)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 5′和3′端RACE模板使用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit(寶生物, 大連)合成。

FcGs基因全長克隆Gs基因序列從本實驗室前期測得的中國對蝦轉(zhuǎn)錄組中獲得。Gs基因的全長序列的獲得利用RACE擴增技術(shù)。本實驗所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in the study

基因序列生物信息學(xué)分析5′和3′端擴增序列與轉(zhuǎn)錄組序列的拼接使用Contig Express; 查找基因的開放閱讀框使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/); 分析物種間的同源性使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); 對多個物種該基因編碼氨基酸序列進行多序列比對使用DNAMAN軟件; 構(gòu)建N-J進化樹使用MEGA 6軟件; 預(yù)測信號肽使用SignalP-5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)特性使用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)和ExPASy ProtParam(http://web.ex-pasy.org/protparam/)。

FcGs基因組織表達及處理組實時定量分析由FcGs基因cDNA全長序列設(shè)計qRT-PCR引物Gs-F和Gs-R, 內(nèi)參基因選擇18S-F和18S-R(表 1)。FcGs基因的組織表達、處理組表達變化及篩選干擾靶點所用試劑為ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix(諾唯贊, 南京), 所用儀器設(shè)備為7500 Fast Real Time PCR System(ABI, 美國)。

急性低鹽脅迫實驗及DA、cAMP、PKA、Gs含量和AC、Na+-K+-ATPase活力測定隨機選150尾規(guī)格整齊活力好的中國對蝦, 放在120 L的養(yǎng)殖箱。本實驗分別設(shè)置對照組和急性低鹽脅迫組, 鹽度分別為26和10, 設(shè)置25尾/平行, 每組3個平行。每6h用淡鹽水進行一次鹽度校正。

取樣時間分別是實驗開始后6h、12h、24h、48h和72h, 取0.2 g鰓組織樣品, 加入1∶9的預(yù)冷生理鹽水, 超聲波冰浴破碎組織, 4℃ 4000×g離心20min后取上清液放在-80℃冰箱保存。使用南京建成生物工程研究所和上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行檢測, 檢測方法參照試劑盒附帶說明書。

siRNA干擾實驗基于FcGs基因cDNA全長序列, 設(shè)計G1、G2和G3共3個干擾靶點(表 2)。設(shè)置預(yù)實驗, 選出干擾效果最佳的siRNA靶點。正式實驗設(shè)置干擾組和對照組(NC), 在第二腹節(jié)肌肉進行注射, 標(biāo)準(zhǔn)為1 μg/g。統(tǒng)計實驗開始后48h內(nèi)中國對蝦的累計死亡率。在注射12h、24h和48h時每組隨機選取3尾蝦取鰓組織樣品, 放于液氮中。

表2 本研究所用siRNA序列與NC序列Tab. 2 The sequences of siRNA and NC

2 結(jié)果

2.1 FcGs基因序列分析

FcGs基因全長1692 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為1140 bp, 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)和3′非編碼區(qū)(3′-UTR)長度分別為256和296 bp, 編碼379個氨基酸。FcGs基因編碼的蛋白分子量約為44 kD, 不穩(wěn)定系數(shù)為46.86, 親水性平均值為-0.583, 脂肪系數(shù)為80.53, 理論等電點(pI)為7.12, 包括一個功能結(jié)構(gòu)域,為無信號肽的非分泌蛋白, 蛋白結(jié)構(gòu)為不穩(wěn)定親水蛋白。

2.2 FcGs基因同源性分析

將中國對蝦與其他物種FcGs基因的氨基酸序列進行多序列比對并構(gòu)建進化樹。分析得出中國對蝦FcGs基因與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)同源性較高, 分別為99%和97%。進化樹分為脊椎動物和無脊椎動物兩大支, 中國對蝦歸于無脊椎動物節(jié)肢動物門甲殼綱, 與凡納濱對蝦首先聚為一支, 其次為日本囊對蝦(圖 1)。

圖1 基于FcGs基因氨基酸序列構(gòu)建的NJ進化樹Fig. 1 NJ tree based on FcGs amino acid sequences

2.3 FcGs基因在不同組織表達分析

利用RT-PCR分析FcGs基因在中國對蝦7個組織中的表達(圖 2)。結(jié)果顯示鰓表達量顯著高于其他組織(P＜0.05)。

圖2 FcGs基因在中國對蝦不同組織中的表達Fig. 2 The relative expression of FcGs in different tissues of Fenneropenaeus chinensis

2.4 FcGs基因在急性低鹽脅迫下鰓組織中的表達分析

分析FcGs基因在急性低鹽脅迫后鰓組織中的表達 (圖 3)。與對照組相比, 實驗72h內(nèi)FcGs基因整體呈上調(diào)表達, 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在12h時表達量達到最高值, 為對照組的2.019倍。

圖3 FcGs基因在中國對蝦鰓組織中表達情況Fig. 3 The relative expression of FcGs in gill tissues of Fenneropenaeus chinensis

2.5 急性低鹽脅迫對中國對蝦DA、Gs、cAMP和PKA含量的影響

在急性低鹽脅迫下中國對蝦鰓組織中DA、Gs、cAMP和PKA含量與對照組相比整體呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢(圖 4), 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在實驗12h時達到最高值, 分別為對照組的1.256倍、1.449倍、1.359倍和1.202倍。

圖4 急性低鹽脅迫對中國對蝦cAMP信號通路內(nèi)DA含量、Gs含量、cAMP含量和PKA含量的影響Fig. 4 Effects of acute low-salinity stress on DA, Gs, cAMP and PKA content of cAMP signaling pathway in Fenneropenaeus chinensis

2.6 急性低鹽脅迫對中國對蝦AC和Na+-K+-ATPase活力的影響

在急性低鹽脅迫下中國對蝦鰓組織中AC和Na+-K+-ATPase活力與對照組相比整體呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢(圖 5), 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在12h時達到最高值, 分別為對照組的1.488倍和1.507倍。

圖5 急性低鹽脅迫對中國對蝦cAMP信號通路內(nèi)AC活力和Na+-K+-ATPase活力的影響Fig. 5 Effects of acute low-salinity stress on AC and Na+-K+-ATPase activities of cAMP signaling pathway in Fenneropenaeus chinensis

2.7 FcGs基因干擾實驗

篩選干擾靶點利用RT-PCR分析干擾FcGs基因后該基因在鰓組織的相對表達量, 不同靶點的干擾效果有所差異(圖 6)。與對照組相比注射G1靶點后在12h、24h和48h后基因表達量分別為對照組的0.747、0.732和0.822倍, 而注射G2和G3后則分別是0.701、0.938和0.684倍, 以及0.599、0.559和0.720倍。在3個靶點中G3干擾效果最好, 選擇G3干擾靶點進行后續(xù)實驗。

圖6 注射G1、G2和G3后FcGs基因在中國對蝦鰓組織中的表達Fig. 6 Expression of FcGs gene in gill after G1, G2 and G3 injection

siRNA干擾FcGs后死亡率對中國對蝦的FcGs基因進行干擾并進行急性低鹽脅迫, 統(tǒng)計脅迫48h內(nèi)的死亡率(圖 7)。干擾組48h內(nèi)累積死亡率(32%)顯著高于對照組(16%)(P＜0.05)。

圖7 急性低鹽脅迫下注射siRNA干擾的中國對蝦的累計死亡率Fig. 7 Mortality stress of Fenneropenaeus chinensis after acute low-salinity and siRNA interference

3 討論

Gs基因與調(diào)節(jié)離子通道和滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān), 本次實驗通過RACE擴增技術(shù)得到中國對蝦FcGs基因cDNA全長序列, 同源性分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列在物種間同源性較高, 具有Gs基因的典型序列結(jié)構(gòu)和特征, 表明該蛋白在物種間具有較高的保守性。FcGs基因在中國對蝦鰓和肝胰腺中表達量較高, 鰓在調(diào)節(jié)滲透壓和離子轉(zhuǎn)運方面起重要作用[24,25], 是水環(huán)境發(fā)生變化后主要的調(diào)節(jié)器官[26];肝胰腺具有排毒與解毒的作用, 是重要的免疫防御器官[27,28]。由此推測FcGs基因參與中國對蝦滲透壓調(diào)節(jié)以及免疫防御過程。

鹽度是中國對蝦養(yǎng)殖中重要的環(huán)境因子[29—31],為進一步了解FcGs基因及其所在的cAMP信號通路是否在中國對蝦滲透壓調(diào)節(jié)過程發(fā)揮作用開展本次實驗。通過實驗發(fā)現(xiàn)在鰓組織中各項酶活和含量基本都在12h達到最高值, 說明鰓組織在實驗12h時滲透壓調(diào)節(jié)能力達到最大, 與在三疣梭子蟹中[5]的研究結(jié)果和在克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中[32]的研究結(jié)果一致。在本實驗中, 急性低鹽脅迫后中國對蝦體內(nèi)Gs基因表達與Gs含量顯著上調(diào), 上游DA含量上升, 下游cAMP和PKA含量及AC和Na+-K+-ATPase活力上升, 與三疣梭子蟹[5]的研究結(jié)果一致。在推測急性低鹽脅迫下cAMP信號通路在滲透壓調(diào)節(jié)過程中調(diào)控路徑為DA→Gs→AC→cAMP→PKA, 通過調(diào)控下游Na+-K+-ATPase活力, 參與中國對蝦滲透調(diào)節(jié)過程。

通過對急性低鹽脅迫下FcGs基因進行干擾, 統(tǒng)計其48h內(nèi)累積死亡率發(fā)現(xiàn)中國對蝦干擾組死亡率顯著高于NC組(P＜0.05), 說明FcGs基因的表達影響了中國對蝦的存活, 急性低鹽脅迫下中國對蝦FcGs基因的表達有利于中國對蝦的存活。干擾中國對蝦FcGs基因后基因表達量降低, 死亡率升高,推測FcGs基因在急性低鹽脅迫下的滲透壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

Gs是cAMP信號通路中的一個重要的結(jié)合蛋白, 對于調(diào)控下游基因具有重要的作用。通過對中國對蝦FcGs基因的克隆, 并對該基因的功能進行了初步的推測。初步明確了Gs基因在中國對蝦鹽度適應(yīng)過程中的作用, 為水生甲殼動物的在受到鹽度脅迫后的環(huán)境適應(yīng)性調(diào)控機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 有助于解析中國對蝦鹽度適應(yīng)機制, 也為選育抗逆新品種提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。