薛凌展 袁 茵 畢保良 孔令富 嚴 暉 李大鵬 高 宇

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學高原漁業(yè)資源保護與可持續(xù)利用重點實驗室, 昆明 650201; 2. 福建省淡水水產(chǎn)研究所, 福州 350002; 3. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院, 昆明 650201; 4. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430070)

MicroRNA(簡稱miRNA)長度為22 nt左右, 是一類高度保守的小分子非編碼RNA, 具有調(diào)控基因表達的功能[1]。miRNA作為表觀變化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 在硬骨魚類生長發(fā)育、組織器官分化、配子形成, 受精卵發(fā)育、性腺發(fā)育及內(nèi)分泌調(diào)控等方面發(fā)揮作用[2]。

目前研究發(fā)現(xiàn), 生殖細胞中的miRNA和相關(guān)靶基因的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)共同影響脊椎動物性別分化的過程[3,4], 性別分化的關(guān)鍵點是原始性腺轉(zhuǎn)化為精巢或卵巢[5]。因此, 對性別決定與性別分化特異miRNA及其靶基因的鑒定, 及miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究, 能更好地解釋miRNA在精巢和卵巢發(fā)育過程中的重要性[1]。

miRNA在魚類性別分化方面的研究, 大多數(shù)是利用高通量測序技術(shù)對表觀差異進行描述, 并結(jié)合miRNA靶基因的預測與功能鑒定, 進而分析特定miRNA可能的功能。如大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossu)和施氏鱘(Acipenser schrenckii)中具有性別表達差異的miRNA, 其靶基因大多與生殖配子形成相關(guān)[6,7]。在模式動物的研究中, 一些與魚類生殖發(fā)育過程密切相關(guān)的miRNA及其作用機制被解析出來, 如miR-726在減數(shù)分裂的過程中調(diào)控青鳉(Oryzias latipes)聯(lián)會復合體蛋白3(SYCP3), 從而影響精子的發(fā)生[8]; miR-430調(diào)控斑馬魚(Danio rerio)生殖相關(guān)的靶基因(TDRD7、nanos1、vasa和C1q-like因子等), 促進配子的減數(shù)分裂和細胞分化,從而影響原始生殖細胞(PGCs)的發(fā)育和遷徙等過程[9—11]; miR-19a和miR-19b共同調(diào)控黃鱔(Monopterus albus)精巢分化過程的關(guān)鍵基因Dmrt1等[12]。

黃鱔在發(fā)育的過程中具有先雌后雄天然性逆轉(zhuǎn)的特征[13], 近幾年隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展, 黃鱔性腺各個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組信息[14,15], 非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[12,16]和基因組[17]等高通量測序數(shù)據(jù)呈爆發(fā)性增長。通過構(gòu)建的黃鱔基因編輯技術(shù), 鑒定出了一些可能與黃鱔性腺發(fā)育和性別分化相關(guān)的基因或蛋白(Dmrt1、Cyp19a1a和Foxl2等)[18], 黃鱔正逐漸成為研究脊椎動物性腺發(fā)育的模式物種[19]。我們前期研究發(fā)現(xiàn), miR-430b與miR-9分別調(diào)控黃鱔轉(zhuǎn)錄因子Foxl2和Foxl3[16,20]。因此, 本研究通過在黃鱔受精卵中過表達miR-9的生物學研究, 探討miR-9對內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的調(diào)控通路, 為闡明黃鱔性別分化的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黃鱔人工繁育試驗在中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所基地開展, 催產(chǎn)方法參考胡煒等[21]的研究, 雌鱔每1 kg體重注射30 mg PG+100 μg LHRH-A2+5000 IU HCG; 采用一針注射法, 雌鱔注射24h后, 雄鱔按50 μg/1kg體重注射LHRH-A2。雌鱔效應(yīng)期約40h后, 人工獲取卵子和精子, 半干法人工授精, 得到黃鱔I細胞期的受精卵。

1.2 黃鱔miR-9前體序列的克隆與分析

以其他物種的miR-9的成熟序列在黃鱔參考基因組(AssemblyM.albus1.0)[17]中進行比對, 發(fā)現(xiàn)1處可能的miR-9前體序列, 通過Primer3Plus軟件分別在成熟序列上下游400 bp左右的位置設(shè)計一對引物(表 1), 引物由天一輝遠生物科技有限公司合成。

根據(jù)組織DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek)說明書要求提取黃鱔卵巢基因組DNA, 以黃鱔DNA為模板, 采用PremixTaq酶(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)擴增目的基因, 擴增完成后, 按照DNA凝膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek)說明書要求進行目的基因的回收與純化, 將目的基因與pMD19-T載體(TaKaRa)連接后的產(chǎn)物, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α, 在含有氨芐青霉素Amp(100 μg/mL)的LB平板上進行篩選。經(jīng)PCR鑒定后, 將陽性克隆送往天一輝遠生物科技有限公司測序, 用雙脫氧鏈終止法測序。

檢查測序峰圖后, 用miRBase BLASTN[22]對所測miR-9前體序列進行分析; Clustal W方法[23]比較不同物種之間miR-9前體序列的相似度; RNAfold Server[24]根據(jù)最小自由能和堿基對概率預測miR-9前體的二級結(jié)構(gòu)。

1.3 受精卵的顯微注射

黃鱔miR-9模擬物(agomiR-9)及相應(yīng)的陰性對照(agomiR-NC)由吉瑪基因股份有限公司合成, 模擬物以及陰性對照按說明書要求溶解于DEPC水中備用。

黃鱔miR-9模擬物 agomiR-9: sense: 5′-UCUU UGGUUAUCUAGCUGUAU-3′

陰性對照agomiR-NC: sense: 5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′

將受精卵置于培養(yǎng)皿中, 在體式顯微鏡(Nikon)下調(diào)整黃鱔胚胎動物極朝上, 用氮氣加壓的定量顯微注射系統(tǒng)(Warner PLI-100A)逐枚注射到黃鱔I細胞期受精卵中, 每個受精卵分別注射2 nL 的agomiR-9(2 μmol/L)、陰性對照agomiR-NC(2 μmol/L)和DEPC處理水。注射部位為受精卵動物極。顯微注射后的受精卵放在與對照組溫度、光照等條件相同的孵化盆中孵化。曝氣水中28℃下分別孵育24h、48h和72h, 每組取10個受精卵混合, 3次生物學重復,分別標記為agomiR-9、agomiR-NC和Control后, 立即轉(zhuǎn)入液氮中保存, 用于提取總 RNA、進行轉(zhuǎn)錄組測序等后續(xù)實驗。

1.4 總RNA的提取與目的基因的克隆

按照Trizol Reagent(Invitrogen)說明書的要求提取6個受精卵樣品的總RNA, 每個RNA樣品中加入2 U的RNase-free DNase, 37℃孵育30min, 隨后加入2 μL EDTA終止反應(yīng), 去除基因組DNA的污染。RNA濃度分別用微量核酸檢測儀Nanodrop 2000c(Thermo scientific)和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technolo-gies)上評估RNA質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis(Thermo scientific K1622)說明書要求反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 目的基因克隆的方法同前。

1.5 黃鱔受精卵miR-9和foxl3的表達量分析

反轉(zhuǎn)錄體系中分別加入miR-9特異莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和u6的下游引物(表 1), cDNA于-20℃保存。熒光定量反應(yīng)體系均為20 μL, 2×Master qPCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)10 μL, 上游引物(20 μmol/L)1 μL, 下游引物(20 μmol/L)1 μL, 5倍稀釋的cDNA模板2.0 μL, RNase/DNase free H2O補足20 μL。

Real-time PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR儀中進行。反應(yīng)條件為: 95℃ 1min;然后進行40個循環(huán), 其條件為95℃ 10s, 60℃ 20s,72℃ 20s; 72℃延伸時采集熒光信號。陰性對照以無RNase的H2O代替 cDNA模板, 每個樣品及陰性對照均設(shè)3個重復。根據(jù)溶解曲線判斷引物的特異性。選取黃鱔u6 snRNA作為miRNA real-time PCR的內(nèi)參基因[25], 結(jié)果采用2-ΔΔCt法[26]對miRNA進行相對表達量分析。將含有目的基因的質(zhì)粒作為標準品, 并用微量核酸檢測儀Nanodrop 2000c測定質(zhì)粒濃度, 計算出標準品的拷貝數(shù), 將標準品10倍梯度稀釋, 構(gòu)建標準曲線。陰性對照以無RNase的H2O代替 cDNA模板, 每個樣品及陰性對照均設(shè)3個重復。根據(jù)標準曲線計算目的基因在受精卵中的拷貝數(shù)(copies/μL)。

半定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad T100 PCR儀中進行。PCR反應(yīng)體系均為50 μL, PCR mix(北京擎科生物科技有限公司)46 μL, 上游引物(20 μmol/L)1 μL,下游引物(20 μmol/L)1 μL, cDNA模板2.0 μL。反應(yīng)條件為: 98℃ 2min; 然后進行30個循環(huán), 其條件為98℃ 10s, 60℃ 30s, 72℃ 30s; 最后72℃ 1min結(jié)束反應(yīng)。擴增完成后, 取PCR產(chǎn)物5 μL, 1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.6 黃鱔受精卵的轉(zhuǎn)錄組測序

對總RNA質(zhì)量進行完整的測量并檢測合格之后, 用帶有oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 使用fragmentation buffer將富集的mRNA隨機打斷成短片段。以mRNA為模板, 使用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA, 再通過DNA聚合酶I, RNase H和dNTP合成第二鏈cDNA。按照QIAquick PCR純化試劑盒說明書要求進行末端修復純化雙鏈cDNA,并添加poly(A)連接至測序接頭。瓊脂糖凝膠電泳選擇不同大小的連接產(chǎn)物, 通過PCR擴增構(gòu)建出不同大小的cDNA文庫, 對文庫使用Illumina HiSeq 2500進行測序(廣州基迪奧生物科技有限公司)。

1.7 差異基因的篩選

測序之后, 首先對初始數(shù)據(jù)Raw Reads進行質(zhì)量檢測和過濾, Raw Reads經(jīng)過去接頭、去除低質(zhì)量Reads后得到Clean Reads, 后續(xù)的分析均以Clean Reads為標準。

使用HISAT2 v2.05軟件[27], 將Clean Reads與黃鱔參照基因組(AssemblyM. albus1.0)[17]進行比對,計算每個基因FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)在不同樣本中的表達量。DESeq2 v1.61軟件[28]比較兩個組合之間的差異表達, 使用錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)來調(diào)整所得的P值的閾值, 將差異倍數(shù)(Fold Change, FC)|log2FC|≥ 1.5且FDR＜0.05 作為差異表達基因的篩選標準。

1.8 差異表達基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

通過clusterPofiler v3.4.4軟件[29]實現(xiàn)差異表達基因的 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。將篩選獲得的差異基因, 通過Omicshare云平臺(https://www.omicshare.com/), 對差異表達基因進行GO 功能注釋和 KEGG 通路富集分析可視化。

1.9 候選基因在黃鱔性腺轉(zhuǎn)錄組中的表達分析

從NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫中獲取黃鱔性腺轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù), 黃鱔卵巢、卵睪體和精巢的登錄號分別為SRR1993742、SRR1993743和SRR1993744。Raw Reads經(jīng)過去接頭、去除低質(zhì)量Reads后, 得到的Clean Reads進行分析。每個數(shù)據(jù)集的Reads數(shù)通過edgeR程序包進行歸一化, 不同樣本的數(shù)據(jù)以RPKM/FPKM標準化(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的reads/fragments)進行差異基因表達分析。使用錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)來調(diào)整所得的P值的閾值, 將FDR＜0.01作為差異表達基因的篩選標準。

1.10 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均采用以平均值±標準差(mean±SD)表示, 用SPSS v22.0軟件(IBM SPSS Statistics for Windows)進行統(tǒng)計與分析。檢測實驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布和方差齊性后, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA)Tukey’sHSD檢驗,P＜0.01認為在統(tǒng)計學具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 黃鱔miR-9前體序列的克隆與分析

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中哺乳類、魚類、兩棲類和無脊椎動物等物種miR-9前體序列的信息, miR-9成熟序列在不同分類階元的物種中保守程度較高。黃鱔miR-9前體序列與袋獾(Sarcophilus harrisii)、中國倉鼠(Cricetulus griseus)和小鼠(Mus musculus)相似性較高, 為94.7%; 與囊舌蟲(Saccoglossus kowalevskii)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)相似性較低, 為74.7%。通過克隆測序確定黃鱔miR-9的成熟序列為mal-miR-9: 5′-TCTTTGGTTATCTAG CTGTAT-3′。RNA二級結(jié)構(gòu)預測中, 黃鱔miR-9前體序列構(gòu)成莖環(huán)結(jié)構(gòu), 預測的最佳二級結(jié)構(gòu)最小自由能(MFE)為-27.90 kcal/mol, 熱力學總體自由能為-29.35 kcal/mol。

2.2 注射miR-9模擬物后黃鱔受精卵中miR-9的表達量

受精后24h、48h和72h, miR-9的表達量在各時間點之間均無顯著性差異,foxl3無明顯表達(圖 1A)。

顯微注射模擬物后, DEPC處理水試劑對照組(Control-DEPC)、miRNA模擬物對照組(agomiRNC)與空白對照組(Control)相比, miR-9的表達量在注射后24h和48h內(nèi)無明顯變化(P＞0.01)。受精后24h和48h, miR-9的拷貝數(shù)均為4×106copies/μL左右(圖 1C)。注射miR-9模擬物48h后, 黃鱔受精卵中miR-9的表達量與對照組相比升高30000倍以上(圖 1B,P＜0.01)。

圖1 受精后不同時間和顯微注射后miR-9在黃鱔受精卵中的表達量Fig. 1 Expression of miR-9 in fertilized eggs of rice field eel after fertilization and injection

2.3 黃鱔受精卵轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估

黃鱔受精卵轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示, 總共獲得Raw bases 為43399558800, Clean bases為42976103056。測序質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果表明, 測序的質(zhì)量值 20(Q20)百分比均超過 98%, 質(zhì)量值 30(Q30)百分比均超過94%, GC 含量所占比例為 49.66%—50.56%(表 2)。測序質(zhì)量總體較好, 可進行后續(xù)分析。

表2 黃鱔受精卵轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab. 2 Summary statistics of rice field eel fertilized egg transcriptome sequencing data

2.4 miR-9注射黃鱔受精卵轉(zhuǎn)錄組分析

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與黃鱔參考基因組進行比對, 所有6個測序樣本中均有92%以上的reads可以比對到黃鱔參考基因組。根據(jù)全部可定位到基因組上的reads(Total Mapped reads)比對結(jié)果, 大部分reads在參考基因組中的分布位置為外顯子區(qū)域。黃鱔受精卵注射miRNA模擬物48h后, 與對照組(Control)相比, 493個基因表達量上調(diào), 228個基因表達量下調(diào); 與陰性對照組(agomiR-NC)相比, 526個基因表達量上調(diào), 435個基因表達量下調(diào); Control與agomiR-NC之間, 16173個基因表達量差異不顯著。分別將3個處理組之間進行兩兩比較, 選擇agomiR-9與對照組之間(Controlvs. agomiR-9和agomiR-NCvs. agomiR-9表達量差異顯著的基因,對照組與陰性對照組之間(Controlvs. agomiR-NC)表達量差異不顯著的基因, 并求三者的交集, 最終篩選得到157個基因(圖 2)。

圖2 不同處理組之間兩兩比較的Venn圖Fig. 2 Venn diagram of pairwise comparison between different treatment groups

2.5 差異表達基因的GO功能注釋

篩選出來的157個候選基因 GO 功能富集涉及生物過程(Biological processes)、細胞組分(Cellular components)和分子功能(Molecular functions)中33個小類(圖 3), 其中生物過程15個, 包括單組織過程、細胞過程、新陳代謝過程、生物調(diào)控過程、發(fā)育過程和負調(diào)控過程等; 細胞組分13個, 包括細胞、細胞組分和膜組分等; 分子功能5個, 包括催化活性、轉(zhuǎn)運活性和信號轉(zhuǎn)導活性等。生長(GO:0040007,Pvalue=0.002304)、肌肉器官形態(tài)發(fā)生(GO:0048644,Pvalue=0.003119)、肌肉組織形態(tài)發(fā)生(GO:0060415,Pvalue=0.003119)為顯著性GO富集條目。

圖3 差異表達基因的GO功能注釋Fig. 3 GO function annotation of differentially expressed genes

2.6 差異表達基因的KEGG功能富集分析

篩選出來的157個候選基因進一步通過 KEGG系統(tǒng)分析差異基因涉及的代謝途徑, 去除人類疾病后, 涉及有機體系統(tǒng)、新陳代謝、細胞生理過程、遺傳信息處理過程、環(huán)境信息處理過程5大類, 其中有機體系統(tǒng)包括消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等10個小類代謝通路(圖 4A)。蛋白質(zhì)消化吸收(ko04974,FDR=0.032175)、細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用(ko04512,FDR=0.04193)、松弛素信號通路(ko04926,FDR=0.047354)為顯著性KEGG富集條目(圖 4B)。

圖4 差異表達基因的KEGG功能富集Fig. 4 KEGG functional enrichment of differentially expressed gene

2.7 miR-9模擬物注射黃鱔受精卵中差異表達基因的篩選

基于miR-9模擬物和對照組受精卵中基因FKPM 值變化倍數(shù), 篩選到 28個差異表達基因(表 3)。tektin 4基因(tekt4)、環(huán)腺苷酸環(huán)化酶合成酶2a(adcy2a)、Ⅰ型細胞骨架角蛋白13(k1c13)、視黃醇脫氫酶5(rdh5)、lefty1基因(lft1)和膠原蛋白2(coll2)等基因的表達量在注射miR-9模擬物后出現(xiàn)不同程度的升高。成纖維細胞生長因子13b(fgf13b)、促甲狀腺激素釋放激素受體2(trhr2)、Claspin基因(clspn)、膠原蛋白XXI型α1(col21a1)、副腫瘤抗原Ma1(pnma1)、氯離子通道蛋白a3(slc26a3)和甜菜堿-同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(bhmt)的表達量在注射miR-9模擬物后出現(xiàn)不同程度的降低。

表3 篩選差異表達的基因Tab. 3 Filter differentially expressed genes

2.8 候選基因在黃鱔性腺轉(zhuǎn)錄組中的表達分析

分析篩選到的28個候選基因在黃鱔性腺轉(zhuǎn)錄組的表達量, 23個候選基因在黃鱔卵巢、卵睪體和精巢中無顯著表達差異(FDR＞0.01), 5個候選基因表達差異顯著(圖 5,FDR＜0.01)。即精巢中l(wèi)ft1和coll2基因的表達量顯著高于卵巢中(FDR＜0.01); 精巢中l(wèi)fg1基因的表達量顯著高于卵睪體中, 而精巢中clspn基因的表達量顯著低于卵睪體中(FDR＜0.01);精巢中pnma1基因的表達量顯著高于卵巢和卵睪體中(FDR＜0.01)。

圖5 候選基因在黃鱔性腺轉(zhuǎn)錄組中的表達差異Fig. 5 Differential expression of candidate genes in gonadal transcriptome of rice field eels

2.9 視黃醇脫氫酶基因(rdh5)及松弛素家族基因(rln)的組織表達分布

以目的基因在肝臟中的表達量為對照, 對其他器官中的表達量進行均一化(圖 6)。rdh5在黃鱔眼睛中具有最高的表達水平(P＜0.01), 而在腦、血液、精巢和卵巢中幾乎沒有表達(P＜0.01)。rln3a和rln3b在黃鱔成魚中的組織表達模式類似, 均在腦中和精巢中具有較高的表達水平, 但rln3a在眼睛中的表達量顯著高于肝臟中的表達量(P＜0.01)。rln3a和rln3b在腦中的表達水平分別比肝臟中高600倍和35倍左右(P＜0.01), 在精巢中的表達水平分別比肝臟中高150倍和5倍左右(P＜0.01)。

圖6 rdh5、rln3a和rln3b基因在黃鱔成魚不同組織中的表達Fig. 6 Tissues distribution of candidate genes rdh5, rln3a and rln3b in rice field eels

3 討論

miR-9廣泛存在于不同物種中, 并參與調(diào)控個體生長發(fā)育、細胞更新和細胞多向分化等生理過程[30]。近年來miR-9的研究大多集中于胚胎干細胞的發(fā)育與分化, miR-9通過下調(diào)HDAC5激活MEF2CGPM6A通路[31], 促進胚胎干細胞向神經(jīng)元祖細胞分化[32]。另外, miR-9表達于小鼠和斑馬魚的眼睛組織中, 推測可能與眼睛的發(fā)育或視覺功能的維持相關(guān)[33,34]。Rdh5作為視覺周期中的一種關(guān)鍵酶, 可以引發(fā)一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)生視色素從而實現(xiàn)光電信號轉(zhuǎn)換, 并參與視黃酸的形成[35]。本研究在miR-9過表達的受精卵中篩選到rdh5基因, 并且在黃鱔眼睛中高表達, 推測miR-9可能通過對rdh5基因的調(diào)控從而影響視覺功能的發(fā)育或維持。

我們之前研究發(fā)現(xiàn)miR-9等8個miRNA共同調(diào)控靶基因foxl3的表達[20], Foxl3的主要功能是抑制雌性生殖細胞中精子的發(fā)生, 同時Foxl3的敲除并不影響卵母細胞的發(fā)育[36]。在本研究中,foxl3在受精后24h、48h和72h內(nèi)幾乎沒有表達; 顯微注射miR-9模擬物后,foxl3在Control、agomiR-NC和agomiR-9組中的平均reads(FPKM)數(shù)分別為15(0.59)、19.5(0.87)和23(0.93), 均沒有顯著性差異。因此,foxl3在受精后72h之內(nèi)未表達可能是過表達miR-9并沒有導致foxl3表達變化的原因。每個特定的靶基因可以同時被多個miRNA所調(diào)控, 同時每個miRNA可以調(diào)控多個(甚至上百個)靶基因[1],此外過表達miRNA對內(nèi)源蛋白的抑制率一般小于50%[37]。因此, miRNA對靶基因的調(diào)控作用比較溫和, 單一miRNA的過表達可能無法導致單一靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的過度波動。黃鱔受精卵中過表達miR-9后, 篩選出的候選基因中僅有5個基因(lfg1,lft1, coll2, clspn和pnma1)在成熟性腺中具有顯著差異表達, 且與性腺發(fā)育無關(guān)。研究表明Foxl3通過2條通路啟動卵子的發(fā)生, 即一條通路涉及雌性特異性的減數(shù)分裂, 另一條通路涉及促進卵泡的發(fā)育和抑制精子的發(fā)生[38]。在受精后1.3d(1.3 days post fertilization, dpf), 達到50%外包期時黃鱔原始生殖細胞(PGC)主要位于背部軀干兩側(cè), 逐漸延伸到軀干中部和未來的泄殖腔孔之間, 直到8 dpf完全觀察不到PGC[39]。推測受精后72h之內(nèi)的受精卵中存在PGC的遷移, 但并無減數(shù)分裂和卵泡發(fā)育等相關(guān)過程的發(fā)生, 可能是受精卵中foxl3基因幾乎不表達的原因。

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表觀變化的關(guān)鍵因子,在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮協(xié)作作用[40]。因此, 對miRNA單一靶基因的鑒定, 很難解釋特定miRNA的生物學功能; 而對單一miRNA所有起響應(yīng)靶基因的研究, 則更有利于闡述miRNA的生物學功能。miR-9在多種魚類的雌雄性腺中呈現(xiàn)出顯著的表達差異, 如黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)等[41—43]。在其他魚類中, miR-9調(diào)控的靶基因包括類固醇代謝通路中的關(guān)鍵代謝酶, 如芳香化酶(Cyp19a)、類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(StAR)和StAR相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域(STARD5)等[44]。本研究在miR-9過表達的黃鱔受精卵中, 篩選到的松弛素信號通路和雌激素信號通路與生殖細胞的發(fā)育直接相關(guān)。rln3a和rln3b在日本鰻鱺(Anguilla japonica)腦中后區(qū)域高表達[45], 與本研究結(jié)果類似。另外,在斑馬魚幼魚的甲狀腺和胰腺區(qū)域也檢測到松弛素基因的表達, 從而證明了松弛素作為旁分泌和內(nèi)分泌激素的作用[46]。rln3a基因的突變影響羅非魚精子發(fā)生的啟動和精原細胞的增殖, 使之不能正常受精。精子活力相關(guān)參數(shù)顯著低于對照組[47]; 松弛素可能通過調(diào)節(jié)精原細胞的自我更新和促進細胞接觸來影響精子發(fā)生[48]。本研究中rln3a和rln3b呈性腺二態(tài)性表達, 推測可能與黃鱔精巢的發(fā)育過程相關(guān)。

魚類性腺的發(fā)育及成熟主要由下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸為主的神經(jīng)內(nèi)分泌途徑進行調(diào)控[49]。本研究篩選到的adcy2a基因與內(nèi)分泌系統(tǒng)直接相關(guān),涉及雌激素信號通路、卵巢類固醇生物合成、皮質(zhì)醇的合成和分泌等。雌激素可以促進adcy2a的表達, 從而促進間充質(zhì)干細胞中環(huán)腺苷酸(cAMP)的產(chǎn)生[50], cAMP是參與生殖系統(tǒng)發(fā)育的主要調(diào)節(jié)途徑(如Sonic Hedgehog信號)中的關(guān)鍵第二信使[51]。Tekt4特異性表達于小鼠精巢中, 敲除tekt4基因的雄性小鼠精子運動能力嚴重下降, 可能是小鼠弱精癥和雄性不育的主要原因[52]。目前, 關(guān)于adcy2a和tekt4基因在魚類中的研究還比較有限, 在黃鱔性腺中均無特異性表達差異, 因此miR-9與adcy2a和tekt4基因調(diào)控關(guān)系以及對魚類性腺發(fā)育的影響需要進一步研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-9在黃鱔性腺發(fā)育過程中表達量逐漸降低, 在卵睪體中具有最高的表達量, 而后在精巢中表達量降低[16]; 而miR-9在豬精巢成熟過程中的表達量呈現(xiàn)升高的趨勢[53]。黃鱔卵睪體階段處于性腺由卵巢到精巢的轉(zhuǎn)換期,該階段過程中卵巢逐漸退化, 同時精巢形成, 精子產(chǎn)生。根據(jù)miR-9在黃鱔和哺乳動物性腺中的表達規(guī)律, miR-9可能對精巢的發(fā)育和精子生成具有重要的調(diào)控作用。綜上, 我們推測miR-9可能通過松弛素信號通路調(diào)控精子功能的相關(guān)蛋白, 進而影響黃鱔精巢的發(fā)育過程。