燕 然， 邢向英， 董慶霖， 于仙永， 史康麗

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院 代謝工程實驗室， 天津 300130）

0 引言

微藻是脂類和其他生物活性分子 （如蛋白質(zhì)、多糖、多不飽和脂肪酸、色素等）的重要來源，可作為生產(chǎn)生物柴油和高附加值產(chǎn)品的原料[1]。但是，微藻生物柴油的生產(chǎn)成本較高，無法實現(xiàn)可持續(xù)的商業(yè)化生產(chǎn)[2]。 解決此問題的策略有兩個：將藻類與真菌或細菌混合培養(yǎng)，利用微生物與藻類之間的協(xié)同作用，促進藻類生長與脂類合成，以此直接降低生物柴油的生產(chǎn)成本[3]；用微藻生產(chǎn)生物柴油的同時生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品，從而間接降低生產(chǎn)成本[4]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種能夠合成脂類和高附加值的蝦青素的單細胞綠藻，是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良藻種[5]。 雖然雨生紅球藻能夠合成高附加值的蝦青素并且脂類含量較高，但其生長速率慢，生物量低，進而導(dǎo)致脂類產(chǎn)量低。 這是因為雨生紅球藻是弱勢藻類，容易受到有害細菌和真菌的感染，從而使其生長受到抑制[6]。 實際上，在開放式大規(guī)模培養(yǎng)藻類過程中，無菌培養(yǎng)是不可能實現(xiàn)的，有害微生物的污染是任何藻類大規(guī)模生產(chǎn)生物柴油的主要障礙。 因此，如何減緩或消除有害細菌或真菌的感染是促進雨生紅球藻等藻類細胞生長和脂類合成的關(guān)鍵。

在此前的研究中，我們從藍藻Chroococus sp.的培養(yǎng)液中分離得到一株共生真菌Simplicillium lanosoniveum DT06（記為DT06）[7]。DT06 能夠合成一種抑制革蘭氏陰性細菌和部分真菌的新抗生素，并且在無菌條件下能夠促進模式綠藻-衣藻的生長和脂類合成[8]，[9]。 在工業(yè)生產(chǎn)中，雨生紅球藻無法做到無菌培養(yǎng)， 為模擬雨生紅球藻的實際生產(chǎn)過程， 本研究將雨生紅球藻進行不滅菌的開放式培養(yǎng)，以此研究DT06 與雨生紅球藻混合培養(yǎng)對雨生紅球藻生長以及脂類和蝦青素合成的影響。

1 實驗方法

1.1 藻種和菌種

實驗所用雨生紅球藻購于中科院武漢水生生物研究所，保存于4 ℃液體BBM 培養(yǎng)基中[5]。BBM液體培養(yǎng)基的配方：NaNO3250 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，NaCl 25 mg/L，Na2MoO41.79 mg/L，KOH 31 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，MnCl2·4H2O 1.44 mg/L，CuSO4·5H2O 1.57 mg/L，EDTA·Na2（乙二胺四乙酸二鈉）50 mg/L，H3BO311.4 mg/L，K2HPO4·3H2O 75 mg/L，KH2PO4175 mg/L，CaCl2·2H2O 25 m g/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L。

DT06 從藍藻Chroococus sp. 的培養(yǎng)液中分離，并保存于中國科學(xué)院微生物研究所菌物標(biāo)本館（編號HMAS 242045）[7]。

1.2 儀器與設(shè)備

GXZ－300D 型光照培養(yǎng)箱、LRH－150S 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱、HZQ－QG 型全溫振蕩器、723N 型可見分光光度計、XSZ－H 型光學(xué)顯微鏡、YX280型加壓滅菌鍋、LG16－B 型臺式高速離心機、DH－101－0S 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GC-AGILENT 7890B 型氣相色譜儀。

1.3 雨生紅球藻接種液及DT06 孢子懸浮液的制備

雨生紅球藻接種液的制備： 將5 mL 活化的雨生紅球藻細胞接種到含有100 mL BBM 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中， 置于光照搖床[溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min，光照強度為60 μmol/（m2·s）]中培養(yǎng)，培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，離心（9 000 r/min，10 min）收集細胞，用BBM 培養(yǎng)基洗滌兩次，制備雨生紅球藻接種液（細胞濃度為2.5×105個/mL）。

DT06 孢子懸浮液的制備：將DT06 劃線接種于PDA 瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，無水葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L）上，在28 ℃下培養(yǎng)7 d 后，用20 mL 無菌水從瓊脂平板上采收真菌孢子， 制備孢子懸浮液（孢子濃度為1.25×107個/mL）。

1.4 雨生紅球藻單獨培養(yǎng)及混合培養(yǎng)

雨生紅球藻滅菌單獨培養(yǎng)（AH）：在裝有100 mL 滅菌的BBM 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中接種體積分數(shù)為10%的雨生紅球藻接種液。

雨生紅球藻不滅菌單獨培養(yǎng)（NH）：除培養(yǎng)基不滅菌外，培養(yǎng)方法與AH 相同。

雨生紅球藻-DT06 不滅菌混合培養(yǎng)（NM）：在含有100 mL 不滅菌的BBM 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中加入體積分數(shù)為10%的雨生紅球藻接種液和DT06 孢子懸浮液的混合液 （雨生紅球藻與DT06 的細胞比為50∶1）。

上述接種后的錐形瓶均置于光照搖床[溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min，光照強度為60 μmol/（m2·s）]中培養(yǎng)。

1.5 參數(shù)測定

1.5.1 生物量及生長動力學(xué)

雨生紅球藻生物量X 的計算式為式中：OD680和OD750分別為雨生紅球藻藻液在680 nm 和750 nm 處的吸光度。

雨生紅球藻的生長速率rg和比生長速率μ的計算式分別為

式中：tn和t0分別為實驗結(jié)束與實驗開始的時間，d；Xn與X0分別為tn與t0時刻雨生紅球藻的生物量，g/L。

1.5.2 硝態(tài)氮濃度

配制濃度分別為0.2，0.5，1，3，5，7 mmol/L 的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，以無氮BBM 培養(yǎng)基作空白， 再分別加入0.4 mL 質(zhì)量分數(shù)為5%的水楊酸-濃硫酸溶液，搖勻，室溫放置25 min 顯色，然后分別加入9.5 mL 質(zhì)量分數(shù)為8%的NaOH 溶液，混勻，冷卻至室溫，用分光光度計在410 nm 處測其吸光值。 以硝態(tài)氮濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度（OD410）為縱坐標(biāo)（y），繪制硝態(tài)氮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 （擬合方程為y=0.084 89 x+0.008 73，R2=0.999）。

取0.1 mL 雨生紅球藻培養(yǎng)液于試管中，重復(fù)上述操作，測定其在410 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算雨生紅球藻培養(yǎng)液中的硝態(tài)氮濃度。

1.5.3 pH

用pH 計測定培養(yǎng)液的pH 值。

1.5.4 脂類產(chǎn)量及脂類合成動力學(xué)

稱取0.05 g 干燥的雨生紅球藻細胞與5 mL氯仿/甲醇（體積比為2∶1）溶液混合，然后在磁力攪拌器上以2 000 r/min 的轉(zhuǎn)速攪拌20 min。 上述步驟重復(fù)2 次，收集氯仿層，在60 ℃下蒸發(fā)至干燥，在分析天平上稱重，得到總脂質(zhì)的質(zhì)量GL。 雨生紅球藻脂類含量G 的計算式為

1.5.5 脂肪酸組成

采用萃取-酯交換法制備脂肪酸甲酯（FAME），取烘干后的總脂與6 mL 甲醇、濃硫酸與氯仿的混合溶液（體積比為2.55∶0.45∶3）混合，90 ℃下水浴90 min 進行脂交換反應(yīng)。 反應(yīng)完成后， 收集含有FAME 的氯仿層。 采用GC-Agilent 7890B 型氣相色譜儀和Agilent INNOWAX 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm） 分析雨生紅球藻的脂肪酸組成。 將初始柱溫設(shè)為80 ℃并保持2 min，然后以12℃/min 的升溫速率升溫至140 ℃， 再以20 ℃/min的升溫速率升溫至240 ℃，保持20 min。進樣器和檢測器的溫度分別為250 ℃和280 ℃。 以C17∶0為內(nèi)標(biāo)，將峰面積與FAME 混合標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C22）的峰面積進行比較，對樣品中的FAME 進行定性和定量。

1.5.6 蝦青素產(chǎn)量

蝦青素產(chǎn)量的測定參照文獻[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞生長

2.1.1 生物量

不同培養(yǎng)條件下， 雨生紅球藻的生物量隨培養(yǎng)時間的變化情況如圖1 所示。

圖1 雨生紅球藻生長曲線Fig.1 The growth curves of H. pluvialis

由圖1 可知：在最初2 d（延滯期），AH 的雨生紅球藻生物量緩慢增長，2 d 后開始顯著上升，并于第8 天后穩(wěn)定在1.57 g/L（穩(wěn)定期）；NH 的雨生紅球藻生物量的變化與AH 相似，但低于AH，在實驗結(jié)束時達到1.12 g/L，較AH 低29%；在第2～10 天，NM 的雨生紅球藻生物量增長顯著，并在第12 天達到最高，為2.45 g/L，較AH 和NH 的雨生紅球藻生物量分別提高了56%和119%。 這表明， 與AH 相比，NM 可以促進雨生紅球藻生長，而NH 則抑制其生長。

2.1.2 生長動力學(xué)參數(shù)

雨生紅球藻的生長動力學(xué)分析結(jié)果見表1。

表1 雨生紅球藻的生長動力學(xué)參數(shù)Table 1 The growth kinetic parameters of H. pluvialis

由表1 可知，NM 的雨生紅球藻平均生長速率[194.2 mg/（L·d）]和平均比生長速率（0.25 d-1）均最高，比AH 的雨生紅球藻平均生長速率[120.8 mg/（L·d）]和平均比生長速率（0.21 d-1）分別提高了60.8%和19%， 比NH 的雨生紅球藻平均生長速率[83.3 mg/（L·d）]和平均比生長速率（0.19 d-1）分別提高了133.1%和31.6%。

在NM 中， 雨生紅球藻生物量的提高是由于藻細胞的生長得到了促進， 細胞平均生長速率和平均比生長速率的提高可以證明這一點。DT06 促進雨生紅球藻細胞生長的原因有以下兩個方面：

①DT06 可以通過合成抗生素抑制甚至消除有害微生物（細菌和真菌）。 由于NM 和NH 均為不滅菌培養(yǎng)， 而NH 的雨生紅球藻生物量比AH的雨生紅球藻生物量低， 說明有害微生物會對雨生紅球藻的生長產(chǎn)生抑制； 而NM 的雨生紅球藻生物量高于AH 的雨生紅球藻生物量， 表明NM對有害微生物有抑制甚至消除作用；

②DT06 與雨生紅球藻在代謝方面存在協(xié)同效應(yīng)。 雨生紅球藻在光合自養(yǎng)條件下的生長僅靠光合作用吸收CO2并釋放O2， 而自養(yǎng)條件下CO2的不足和O2的積累都限制了雨生紅球藻的生長；而NM 條件下的DT06 代謝會吸收O2并釋放CO2， 從而促進雨生紅球藻在NM 條件下生長，這與其他微藻-微生物混合培養(yǎng)的機理類似[10]。

2.2 培養(yǎng)液的硝態(tài)氮濃度

在不同培養(yǎng)條件下， 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮濃度的變化如圖2 所示。從圖2 可以看出：在不同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液的硝態(tài)氮濃度的變化趨勢相似；在培養(yǎng)的前2 d，AH 和NH 的培養(yǎng)液硝態(tài)氮濃度急劇下降， 從250 mg/L 分別下降到了73.43 mg/L 和106.43 mg/L， 從第2 天到培養(yǎng)結(jié)束時，AH 和NH的培養(yǎng)液硝態(tài)氮濃度分別緩慢下降到了11.34 mg/L 和18.53 mg/L；在培養(yǎng)至第2 天時，NM 的培養(yǎng)液硝態(tài)氮濃度急劇下降至40.56 mg/L， 第8 天時硝態(tài)氮已檢測不到。 NM 的培養(yǎng)液硝態(tài)氮濃度下降速率較AH 和NH 快， 說明NM 加快了雨生紅球藻對硝態(tài)氮的吸收和利用。

圖2 不同培養(yǎng)條件下硝態(tài)氮濃度的變化Fig.2 Variation of nitrate nitrogen concentration in different cultures

2.3 培養(yǎng)液pH 值

在不同培養(yǎng)條件下， 雨生紅球藻培養(yǎng)液pH值的變化如圖3 所示。

圖3 不同培養(yǎng)條件下pH 值的變化Fig.3 Fluctuation of pH in different cultures

從圖3 可以看出： 隨著實驗的進行，AH 和NH 的培養(yǎng)液pH 值持續(xù)升高，實驗結(jié)束時分別達到9.67 和9.98；相比之下，NM 的培養(yǎng)液pH 值變化相對緩慢，在第8 天后緩慢上升至8.52，然后保持在8.48～8.57。 上述結(jié)果表明，DT06 的代謝穩(wěn)定了NM 的培養(yǎng)液pH 值。 AH 和NH 的培養(yǎng)液pH值快速升高，抑制了雨生紅球藻細胞的生長，這主要是由于雨生紅球藻會吸收生理堿性鹽，如NaNO3，并分泌NH4+[11]。 在NM 中，DT06 會釋放CO2和吸收NH4+，降低并穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH 值，從而有利于雨生紅球藻的生長。 值得注意的是，DT06 在吸收NH4+后， 可能會分泌有機氮以促進雨生紅球藻的生長。

2.4 脂類合成

2.4.1 脂類產(chǎn)量與脂類含量

在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 d 后，雨生紅球藻的脂類產(chǎn)量與脂類含量如圖4 所示。 從圖4 可以看出，NM 的雨生紅球藻脂類產(chǎn)量（0.837 g/L）和脂類含量（341.8 mg/g）均最高，比AH 的雨生紅球藻脂類產(chǎn)量（0.394 g/L）和脂類含量（251.4 mg/g）分別提高了112.4%和36%，比NH 的雨生紅球藻脂類產(chǎn)量（0.221 g/L）和脂類含量（197.5 mg/g）分別提高了279%和73%。

圖4 不同培養(yǎng)條件下的脂類產(chǎn)量和脂類含量Fig.4 The lipid production and lipid content in different cultures

2.4.2 脂類合成動力學(xué)

雨生紅球藻的脂類合成動力學(xué)分析結(jié)果如表2 所示。 由表2 可知，NM 的雨生紅球藻平均脂類合成速率和平均脂類比合成速率均最高， 分別為69.75 mg/（L·d）和28.47 mg/（g·d），比AH 的雨生紅球藻平均脂類合成速率[32.83 mg/（L·d）]和平均脂類比合成速率[20.91 mg/（g·d）] 分別提高了112.5%和36.15%，比NH 的雨生紅球藻平均脂類合成速率[18.42 mg/（L·d）]和平均脂類比合成速率[14.45 mg/（g·d）]分別提高了278.66%和97%。

表2 雨生紅球藻的脂類合成動力學(xué)參數(shù)Table 2 The lipid synthesis kinetic parameters of H. pluvialis

NM 的雨生紅球藻脂類產(chǎn)量提高的原因主要有： 雨生紅球藻生物量的提高為脂類合成奠定了細胞基礎(chǔ)；雨生紅球藻脂類含量、平均脂類合成速率和平均脂類比合成速率的提高。 后者提高的原因可能是：硝態(tài)氮的快速消耗導(dǎo)致氮饑餓，氮饑餓能夠使碳通量流向脂類合成的方向[9]；DT06 產(chǎn)生的CO2提高了CO2濃度，CO2濃度的提高有利于脂質(zhì)的合成[12]。

2.5 蝦青素產(chǎn)量與蝦青素含量

為了研究雨生紅球藻中蝦青素含量的變化，本研究測定了不同培養(yǎng)條件下的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同培養(yǎng)條件下的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量Fig.5 The astaxanthin production and astaxanthin content in different cultures

結(jié)合圖4，5 可以看出，在不同培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量與脂類產(chǎn)量和脂類含量的變化相一致。 NM 的雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量均最高， 分別為88.84 mg/L 和36.26 mg/g，AH 的雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量分別為51.04 mg/L 和32.51 mg/g，NH 的雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量分別為32.31 mg/L 和28.85 mg/g；NM 的雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量和蝦青素含量分別比AH 的雨生紅球藻提高了74%和11.53%，比NH 的雨生紅球藻提高了175%和25.68%。 NM 的雨生紅球藻的蝦青素產(chǎn)量提高的原因與脂類產(chǎn)量提高的原因相似甚至相同，這是由于蝦青素是脂溶性色素，分散在雨生紅球藻細胞的脂滴中[13]。因此，蝦青素和脂類的合成密切相關(guān)，有利于脂類合成的條件，同樣有利于蝦青素合成[14]。

2.6 脂肪酸組成

不同培養(yǎng)條件下， 雨生紅球藻油脂的主要脂肪酸組成見表3。 由表3 可以看出，雨生紅球藻在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的脂肪酸分布在C14～C22范圍內(nèi)，主要為C16～C18，適合生產(chǎn)生物柴油。AH和NH 的雨生紅球藻中，C16～C18 脂肪酸的含量分別為82.6%和80.71%， 而NM 的雨生紅球藻中，C16～C18 脂肪酸的含量可達到83.19%， 高于AH 和NH 的雨生紅球藻。 油酸（C18∶1）是衡量生物柴油質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，其占NM 的雨生紅球藻總脂肪酸的21.69%， 分別比AH 的雨生紅球藻（19.95%）和NH 的雨生紅球藻（17.59%）提高了8.72%和23.3%。 NM 的雨生紅球藻細胞中飽和脂肪酸（SFA）含量為36.12%，比AH 的雨生紅球藻（34.62%）和NH 的雨生紅球藻（33.59%）分別提高了4.3%和7.5%。 C16～C18 脂肪酸 （特別是油酸） 在NM 的雨生紅球藻中富集的原因可能是，DT06 釋放的CO2提高了培養(yǎng)液的CO2濃度，從而影響了雨生紅球藻細胞中脂肪酸的組成[15]。 DT06的加入促進了雨生紅球藻油酸的積累， 對于生物柴油質(zhì)量和產(chǎn)量的提高均有重要意義。

表3 不同培養(yǎng)條件下雨生紅球藻的脂肪酸組成Table 3 The fatty acid composition of H. pluvialis in different cultures %

3 結(jié)論

本研究將雨生紅球藻與DT06 在不滅菌條件下混合培養(yǎng)（NM），發(fā)現(xiàn)DT06 能夠促進雨生紅球藻脂類和蝦青素合成。 與雨生紅球藻滅菌單獨培養(yǎng)（AH）和不滅菌單獨培養(yǎng)（NH）相比，NM 的雨生紅球藻生物量分別提高了56%和119%， 油脂含量分別提高了112.4%和279%， 蝦青素含量分別提高了74%和175%。 在NM 過程中，DT06 能夠穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH 值，促進氮代謝，提高雨生紅球藻的生長速率和油脂合成速率。 NM 的雨生紅球藻的C16～C18 脂肪酸含量可達到83.19%， 適合生物柴油生產(chǎn)。 因此，DT06 與雨生紅球藻混合培養(yǎng)為生物燃料和高附加值產(chǎn)品的聯(lián)合生產(chǎn)提供了一條有效途徑。