石小威 王 茂 陳鴻真 高 磊 劉曉聰 楊承忠 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶401331)

黏孢子蟲(Myxosporeans)是一類個(gè)體微小、形態(tài)簡(jiǎn)單且分布廣泛的后生動(dòng)物寄生蟲, 主要寄生于魚類, 少數(shù)寄生于兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類[1—3]。迄今已記錄的黏孢子蟲有2600余種[4]。碘泡蟲科(Myxobolidae Thélohan, 1892)是黏孢子蟲中最大的一科, 包含碘泡蟲屬(MyxobolusBütschli,1882)、單極蟲屬(ThelohanellusKudo, 1933)和尾孢蟲屬(HenneguyaThélohan, 1892)等, 其中碘泡蟲屬是該科中物種最豐富的屬, 約有900種之多[5]。黏孢子蟲早期的分類主要基于孢子形態(tài), 然而后來(lái)大量的研究表明, 經(jīng)典分類學(xué)很難對(duì)形態(tài)相似種進(jìn)行有效區(qū)分, 特別是當(dāng)其宿主特異性和組織趨向性極其相似的情況下, 鑒定工作尤為困難[6—9]。近30年來(lái),分子生物學(xué)方法的介入, 為黏孢子蟲分類學(xué)的發(fā)展起到了極大的促進(jìn)作用, 解決了諸多經(jīng)典分類學(xué)未能妥善處理的問(wèn)題, 厘清了過(guò)去一些類群劃分和物種鑒定的遺留問(wèn)題[8,10,11]。然而在全世界所記錄的黏孢子蟲中, 僅有約23%的物種具有分子序列數(shù)據(jù),因此仍有大量已知種的分子信息亟待補(bǔ)充和完善[4]。

鯽(Carassius auratusLinnaeus)具有生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn),是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類[12]。同時(shí), 鯽也是黏孢子蟲病發(fā)生率較高的經(jīng)濟(jì)魚類之一, 據(jù)統(tǒng)計(jì), 寄生于鯽的碘泡蟲就達(dá)64種之多[13—15], 其中包含尖形碘泡蟲Myxobolus acutusWu and Chen, 1987。尖形碘泡蟲由吳灶和與陳啟鎏在湖北五湖發(fā)現(xiàn)并命名, 其宿主為鯽, 寄生部位為腎和鰓[16]。因條件限制, 當(dāng)時(shí)并未提供分子序列信息。本研究在嘉陵江重慶段檢獲尖形碘泡蟲, 宿主為鯽, 寄生部位為鰓和膽囊, 這是續(xù)發(fā)現(xiàn)該物種30余年以來(lái)的第一次記錄。本研究首次提供了尖形碘泡蟲的18S rDNA及ITS1序列, 并基于形態(tài)和分子信息對(duì)其進(jìn)行重描述的基礎(chǔ)上, 開展了分子系統(tǒng)學(xué)研究, 以期為人們進(jìn)一步了解該寄生蟲的進(jìn)化生物學(xué)特征及魚類病原鑒定積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與物種鑒定

2015年4月、2018年4月和2019年5月在嘉陵江重慶段共采集鯽76尾。活體送往重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用過(guò)量的MS-222麻醉劑(350 mg/L)進(jìn)行安樂(lè)死, 隨后剖檢, 用肉眼檢查體表、鰓、肌肉、肝胰臟、腸、脾臟、心臟、膽囊、腎臟、膀胱等部位是否有明顯病癥及黏孢子蟲孢囊, 鏡檢各組織器官涂片中分散孢子的存在。后對(duì)獲取的黏孢子蟲新鮮樣本直接進(jìn)行圖像采集(圖 1)及基因組DNA提取等工作, 對(duì)黏孢子蟲樣本的處理和種類鑒定參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

圖1 尖形碘泡蟲重慶株系孢子形態(tài)Fig. 1 Morphology of Myxoblus acutus of Chongqing strain

1.2 DNA提取與PCR反應(yīng)

DNA提取將從宿主鯽的鰓部獲得的黏孢子蟲孢囊用鑷子小心地剝離至1.5 mL離心管中, 用滅菌后的解剖針戳破后立即挑取部分孢子鏡檢, 顯微拍照, 剩下的孢子分散于盛有滅菌雙蒸水的離心管中, 離心富集, 懸浮洗2—3次以除去雜質(zhì)。從宿主膽囊中檢獲的黏孢子蟲立即鏡檢, 顯微拍照, 剩余膽汁保存于1.5 mL離心管中, 從離心管中吸取10 μL含有孢子的膽汁, 用滅菌后的雙蒸水清洗2—3次,除去雜質(zhì)。按照DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒的使用說(shuō)明書對(duì)黏孢子蟲基因組DNA進(jìn)行提取, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),將獲得的基因組DNA溶液在-20℃條件下保存?zhèn)溆?。另? 按照海洋動(dòng)物組織 DNA提取試劑盒(TIANGEN, China)的說(shuō)明書對(duì)宿主魚基因組DNA進(jìn)行提取, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 將獲得的宿主魚基因組DNA溶液在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)對(duì)提取成功的黏孢子蟲樣本基因組DNA進(jìn)行18S rDNA序列片段擴(kuò)增, 擴(kuò)增引物為18E: 5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′和18R: 5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′[17,18]。20 μL的PCR反應(yīng)體系: 引物各0.5 μL, 模板DNA 5 μL, Mix(上海英濰捷基生物公司)5 μL, 然后添加超純水補(bǔ)至20 μL; 反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性90s, 94℃變性20s, 56℃退火20s, 72℃延伸2min, 循環(huán)35次, 最后72℃再次延伸5min, 反應(yīng)完成后于PCR儀12℃條件下保溫。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 然后將有目的條帶的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(OMEGA, America)純化回收。將每個(gè)回收產(chǎn)物插入pMD18-T載體(TaKaRa,Japan), 隨后導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行單克隆培養(yǎng), 將2個(gè)克隆子送英濰捷基(上海)生物公司測(cè)序。黏孢子蟲ITS1序列擴(kuò)增引物為28S1R: 5′-GTGTTTCAAGACGGGTCG-3′和ERIB10-V: 5′-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3′, 采用上述相似的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。宿主魚的COI基因部分序列的PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[19]。

1.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育

序列分析樣本序列與相似度較高物種序列之間的遺傳距離用MEGA6.0軟件在K2P模型下計(jì)算獲得。序列相似度借助在線軟件Pairwise Sequence Alignment (網(wǎng)址: www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)基于Global Alignment模式計(jì)算獲得。序列間變異位點(diǎn)采用Bioedit軟件分析。

系統(tǒng)發(fā)育分析用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的黏孢子蟲18S rDNA序列共有66條, 其中包括本研究得到的1條尖形碘泡蟲代表序列和65條與尖形碘泡蟲相似度較高的序列(通過(guò)NCBI在線BLAST結(jié)果),包括碘泡蟲、單極蟲、尾孢蟲等。另外, 選用Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(AY074915)為外群。利用在線軟件The CIPRES Science Gateway V.3.3 (網(wǎng)址: http://www.phylo.org/)中的RAxML-HPC2 XSEDE(8.2.12)模式構(gòu)建最大似然樹(Maximum likelihood,ML), 并選擇1000次自舉(Bootstrap)重復(fù)檢測(cè)。利用MrBayes 3.1.2軟件構(gòu)建貝葉斯樹(Bayesian inference, BI), 位點(diǎn)變異設(shè)置為invgamma分布, 序列最佳進(jìn)化模型為GTR+I+G(通過(guò)Model test 3.7計(jì)算獲得), 運(yùn)行10000000代, 每200代抽樣1次, 在舍棄25%的老化樣本后, 根據(jù)剩余樣本構(gòu)建一致樹。系統(tǒng)樹的繪制由FigTree v1.4.2和Photoshop共同完成[20]。

1.4 主成分分析

基于成熟孢子的孢子長(zhǎng)、孢子寬、大極囊長(zhǎng)、大極囊寬、小極囊長(zhǎng)和小極囊寬的測(cè)量值, 利用PAST3進(jìn)行主成分分析(PCA), 以分析尖形碘泡蟲7個(gè)株系間的形態(tài)差異。使用變量協(xié)變矩陣生成具有95.0%置信的散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

基于形態(tài)及COI基因測(cè)序(GenBank登錄號(hào):MZ769123)鑒定宿主魚為鯽。本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)7尾鯽感染尖形碘泡蟲(感染率為9.2%), 其中6尾感染部位為鰓, 均形成乳白色圓形孢囊(直徑為1—2 mm),1尾感染部位為膽囊, 孢子游離于膽汁中, 未形成孢囊。本文將從上述感染宿主中獲得的尖形碘泡蟲分離株稱為株系, 共得到7個(gè)分離株即S1—S7株系,整體稱為重慶株系。

2.1 尖形碘泡蟲Myxobolus acutus Wu and Chen,1987重慶株系形態(tài)學(xué)描述

尖形碘泡蟲重慶株系成熟孢子殼面觀呈梨形,前端稍尖, 后端鈍圓, 縫面觀呈寬紡錘形(圖 1)。孢子長(zhǎng)(13.6±0.9) μm [(11.4—15.3) μm](n=175), 寬(10.2±0.9) μm [(7.5—12.8) μm](n=175), 厚(7.6±0.6) μm[(6.9—8.3) μm](n=5)。兩梨形極囊開口處緊靠并位于孢子前端, 極囊大小不等, 大極囊長(zhǎng)(6.2±0.4) μm[(5.1—7.5) μm](n=175), 寬(3.8±0.4) μm [(2.8—4.7) μm](n=175), 極絲盤繞5—8圈, 小極囊長(zhǎng)(2.7±0.4) μm[(1.7—3.7) μm](n=175), 寬(1.4±0.2) μm [(0.9—1.9) μm](n=175), 極絲盤繞2—3圈。尖形碘泡蟲重慶7株系形態(tài)與原始描述相符(圖 1和表 1)[16]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn), 與尖形碘泡蟲形態(tài)較相似的種有微孢碘泡蟲(Myxobolus microsporesLi and Nie, 1973)、葡萄碘泡蟲(Myxobolus acinosusNie and Li, 1973)和異樣碘泡蟲(Myxobolus diversusNie and Li, 1973)。與微孢碘泡蟲相比, 尖形碘泡蟲的孢子略大(11.3—15.5 μmvs.9.6—12.0 μm)。葡萄碘泡蟲孢子呈茄形, 前端狹窄而稍彎, 這與尖形碘泡蟲的梨形孢子前端略尖且不彎曲的形態(tài)有所不同。異樣碘泡蟲的孢子比尖形碘泡蟲稍大(13.2—16.8 μmvs. 11.3—15.5 μm),且大極囊長(zhǎng)約占孢子長(zhǎng)的1/3, 而尖形碘泡蟲的大極囊長(zhǎng)約占孢子長(zhǎng)的1/2(表 1)[21]。

表1 尖形碘泡蟲與相似種的形態(tài)學(xué)比較Tab. 1 Morphological comparison of Myxobolus acutus with its similar species (μm)

主成分分析結(jié)果顯示, 本研究所檢獲的尖形碘泡蟲7株系間(S1—S7)孢子形態(tài)量度無(wú)顯著差異(圖 2)。

圖2 尖形碘泡蟲重慶各株系主成分分析Fig. 2 Principal component analysis (PCA) for Myxobolus acutus of Chongqing strains

2.2 尖形碘泡蟲18S rDNA分子特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得尖形碘泡蟲S1—S7株系18S rDNA序列片段長(zhǎng)度分別為1851 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782721)、1932 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782722)、1896 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782723)、1871 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782724)、1810 nt(GenBank登錄號(hào): MZ 782725)、1677 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782726)和1839 nt(GenBank登錄號(hào): MZ782727)。7株系間序列相似度為100%, 遺傳距離為0, 變異位點(diǎn)0個(gè), 即7株系18S rDNA序列為同一基因型。尖形碘泡蟲18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的中華單極蟲(Thelohanellus sinensis, KY469292)相似度最高(95.4%), 遺傳距離最小(0.047), 其次為蒼梧碘泡蟲(Myxobolus tsangwuensis, KJ561441; 93.6%, 0.081)和貝殼碘泡蟲(Myxobolus musseliusae, FJ710801;93.2%, 0.080)。

本研究獲得株系S1、S5和S6的ITS1序列, 長(zhǎng)度分別為298、318和318 nt。序列分析結(jié)果顯示, 株系S5與株系S6共享同一基因型, 該基因型與株系S1的基因型序列差異較大, 差異位點(diǎn)數(shù)有168個(gè)(圖 3)。

圖3 尖形碘泡蟲S1、S5、S6三株系間ITS1序列分析Fig. 3 The site variation analysis of ITS1 sequences for the three strains (S1, S5 and S6) of Myxobolus acutus

本研究構(gòu)建的ML樹和BI樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致(圖 4)。系統(tǒng)樹聚為三大支系, 其中進(jìn)化支Clade Ⅰ處于系統(tǒng)樹的基部位置, 后依次為Clade Ⅱ和Clade Ⅲ進(jìn)化支。尖形碘泡蟲位于Clade Ⅲ支系中Subclade A亞支: 尖形碘泡蟲與中華單極蟲(KY469292)聚為一支, 該支與貝殼碘泡蟲(JQ040301)、蒼梧碘泡蟲(KJ561441)和鰓基碘泡蟲(AF507971)形成的進(jìn)化支呈姐妹群關(guān)系(圖 4)。

圖4 基于18S rDNA序列構(gòu)建的ML/BI樹Fig. 4 ML/BI phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences

3 討論

本研究獲得的尖形碘泡蟲孢子形態(tài)符合原始描述。宿主鯽的膽囊為尖形碘泡蟲的感染部位新記錄, 重慶地區(qū)為地理新分布。原始報(bào)道的尖形碘泡蟲僅以游離孢子的形式存在, 而本研究發(fā)現(xiàn)該物種可以形成孢囊。尖形碘泡蟲重慶各株系間成熟孢子形態(tài)相似, 主成分分析結(jié)果進(jìn)一步表明各株系間孢子形態(tài)量度無(wú)顯著差異, 應(yīng)為同一物種。同時(shí),7株系間18S rDNA序列無(wú)差異, 進(jìn)一步證實(shí)這些株系為同一物種。

以往的研究表明, ITS1是研究物種種內(nèi)關(guān)系的理想分子標(biāo)記, 在不同生物類群中得到了廣泛應(yīng)用[22—27], 而在黏孢子蟲類群中的相關(guān)應(yīng)用則很少[28—30]。本研究分別獲得了尖形碘泡蟲S1、S5和S6株系的ITS1序列。序列分析顯示, S5和S6共享1個(gè)基因型, 該基因型與S1的序列存在很大差異(共有168個(gè)差異位點(diǎn))。這表明尖形碘泡蟲在嘉陵江重慶段江域具有一定程度的遺傳多樣性水平, 并且S1可能與S5和S6有著不同的遺傳來(lái)源。

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 處于分化較早支系的寄生蟲其寄生部位表現(xiàn)出了較高的一致性, 如Clade Ⅰ物種的寄生部位均為肌肉, Clade Ⅱ物種的寄生部位均為鰓。而分化較晚的Clade Ⅲ支系, 雖然沒(méi)有完全表現(xiàn)出寄生部位的高度一致性, 但在一些小的進(jìn)化亞支中的物種仍有較為一致的寄生部位(圖 4)。這表明, 碘泡蟲科物種的系統(tǒng)發(fā)育與其寄生部位有著較為密切的關(guān)系。在碘泡蟲科物種進(jìn)化過(guò)程中, 逐漸由原來(lái)的寄生部位高度一致性向多寄生部位演化, 在分化最晚的Clade Ⅲ進(jìn)化支中即出現(xiàn)了一些物種具有多寄生部位的現(xiàn)象(圖 4)。從進(jìn)化角度來(lái)看, 在一個(gè)支系中大多數(shù)物種共有的寄生部位應(yīng)是初始寄生部位, 其他的則是后來(lái)適應(yīng)的新寄生部位。如Subclade A進(jìn)化亞支中, 物種均寄生于鰓部, 而其中的尖形碘泡蟲不僅可寄生于鰓,還可寄生于膽囊(圖 4), 從系統(tǒng)發(fā)育與寄生部位演化的角度推測(cè), 尖形碘泡蟲的初始寄生部位應(yīng)為鰓,而膽囊則是其后來(lái)適應(yīng)的新的寄生部位。