黃偉鵬， 徐碧瑩， 張敏艷， 吳委林， 鄭大浩

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

玉米是全世界也是我國種植范圍最廣、總產(chǎn)量最高的作物[1],含有豐富的玉米黃質(zhì)、維生素E及谷胱甘肽，具有補腦、降糖、降壓降脂、護眼、抗衰老等功效。自然界中，危害玉米的害蟲種類超過90種，蚜蟲是玉米蟲害之一，對玉米產(chǎn)量和質(zhì)量有很大影響[5]。

目前，玉米蚜的防治主要依賴于化學(xué)防治，但是化學(xué)藥品易引起環(huán)境污染，所以，選育推廣抗蚜品種是減輕或避免蚜害的有效途徑。而廣泛存在于禾本科植物中的次生代謝物苯并噁嗪類化合物可作用于玉米抗蚜中[6-7]。苯并噁嗪類化合物能夠幫助玉米從土壤中攝取鐵，將有益微生物吸引到與植物根部接觸的土壤區(qū)域，也能對防御外界脅迫起到一定的促進作用，是玉米適應(yīng)外環(huán)境的重要組件，其中，研究較多的是“的布”和“丁布”。在玉米和麥類作物中，“丁布”含量越高，對蚜蟲抗性越好[16]。

植物中，已發(fā)現(xiàn)的苯并噁嗪類化合物有20多種，苯并噁嗪合成途徑涉及的基因至少有12個， 雖然DIBOA(2,4-二羥基-1,4-苯并噁嗪-3-酮)被認(rèn)為是玉米抗蟲性密切相關(guān)的代謝物質(zhì)[21]，但不同的玉米對抗蟲性存在很大差異其原因是由于DIBOA的含量高低所引起，還是由于DIBOA葡萄糖苷酶的變異所導(dǎo)致的下游苯并噁嗪類物質(zhì)的合成受阻而引起的還不清楚。為此，該研究依據(jù)玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組上所注釋的DIBOA葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因bx8的參考序列，從高抗玉米Mo17苗期葉片中克隆bx8基因，為bx8基因的表達(dá)和功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗用于克隆目的基因bx8的試驗材料為高抗蚜玉米自交系Mo17苗期的葉片。

1.2 方法

1.2.1 玉米DIBOA葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的查詢與引物設(shè)計

首先以玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org)上下載玉米DIBOA葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的基因序列GRMZM2G085054_P01為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 6.0和AutoDimerV 1.0軟件設(shè)計引物，再引入通過DNAStar軟件檢測出的限制性內(nèi)切酶位點，即EcoRⅠ(5′-GAATTC)和XhoⅠ(5′-CTCGAG)限制性內(nèi)切酶位點，正向引物為BX8EC625F1:GAATTCCCAGACAGAGAGGACAGG(下劃線部分為EcoRⅠ限制性酶切位點)，反向引物為BX8XH2277R2:CTCGAGATGATGAATGATGAGAAGC(下劃線部分為XhoⅠ限制性酶切位點)。在玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組中引物區(qū)間內(nèi)目標(biāo)DNA序列長度為1 534 bp。

1.2.2 目標(biāo)DNA片段的PCR擴增

以玉米自交系Mo17為基因組DNA模板進行PCR擴增，選用Promega的PCR試劑盒(Go Taq Green Mix)，PCR反應(yīng)體系參考試劑盒說明書，采用梯度PCR的方法摸索擴增所需最佳溫度，PCR反應(yīng)基本條件在退火溫度48～62 ℃設(shè)置溫度梯度，最終PCR反應(yīng)的體系為模板DNA 2.5 μL；Forward primer 1.25 μL；Reverse primer 1.25 μL；Go Taq Green Mix 12.5 μL；ddH2O 7.5 μL。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收連接及轉(zhuǎn)化

根據(jù)梯度PCR摸索的最佳溫度進行目標(biāo)DNA片段擴增，PCR反應(yīng)結(jié)束后利用1%的瓊脂糖凝膠電泳將大小不同的條帶進行分離，利用凝膠成像儀，在紫外燈照射下快速切取目的條帶，放入事先準(zhǔn)備好的TB管中，利用E.Z.N.A.GelExteaction Kit膠回收試劑盒回收DNA目的片段；回收方法按照試劑盒說明書進行操作，并對回收產(chǎn)物進行電泳檢測，檢測出目的條帶后進行連接，連接載體為pMD19-T，連接條件為4 ℃過夜，連接結(jié)束后，將含有目標(biāo)DNA片段的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素、IPTG、X-Gal的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，利用藍(lán)白斑篩選，選擇陽性菌，即重組質(zhì)粒(白色)。

1.2.4 質(zhì)粒提取與目標(biāo)DNA序列酶切及PCR驗證

挑取白色陽性單菌落進行液體培養(yǎng)，8～10 h后吸取少量菌液與滅菌后的去離子水按1∶20進行稀釋，稀釋后充分混勻進行劃線，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。準(zhǔn)確無誤后利用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒(E.Z.N.A.PlasmidMiniprep Kit)從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，按限制性內(nèi)切酶說明書對所提質(zhì)粒進行雙酶切及其鑒定。酶切驗證正確后，將相應(yīng)的菌液進行擴大培養(yǎng)，保存菌種后，將菌液送到上海生工公司測序。

1.3 目標(biāo)序列的分析

1.3.1 目標(biāo)序列的同源性分析

測序后得到的DNA序列，通過DNAStar軟件和GeneDoc軟件進行同源性比對和序列分析，在NCBI下載禾本科bx8蛋白序列，用軟件MEGA7進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3.2 目標(biāo)基因的生物信息學(xué)分析

目標(biāo)DNA序列編碼的蛋白質(zhì)序列分析，利用NCBI在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對蛋白質(zhì)序列進行同源序列比對；利用在線工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)對蛋白質(zhì)序列進行理化性質(zhì)及親疏水性等一級結(jié)構(gòu)分析；利用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析；利用SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。利用Net Phos3.1預(yù)測磷酸化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的PCR最佳退火溫度摸索

引物BX8EC625F1和BX8XH2277R2分離的目標(biāo)DNA序列區(qū)間長度1 534 bp。為摸索該引物從玉米自交系Mo17中分離目標(biāo)片段的PCR溫度條件，在正向引物和反向引物的適宜范圍內(nèi)設(shè)置溫度梯度，PCR儀自動設(shè)置8個溫度梯度為：45.0、46.4、48.8、52.6、57.1、60.9、63.4和65.0 ℃，結(jié)果見圖1。以Mo17基因組的DNA為模板進行PCR，當(dāng)溫度低于52.6 ℃時，條帶不清晰，目標(biāo)條帶效果不好；溫度在60.9 ℃時，目標(biāo)條帶清晰，效果較好且未出現(xiàn)非特異性條帶。

注：引物擴增的目標(biāo)DNA片段長度為1 380 bp。

2.2 目標(biāo)序列的PCR產(chǎn)物回收與克隆

以DNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物、PCR擴增產(chǎn)物回收、以重組質(zhì)粒為模板的PCR擴增產(chǎn)物、重組質(zhì)粒及重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶所得片段進行比較(圖2)。從圖2可知，目標(biāo)片段均處于同一高度，條帶清晰、明顯，且無雜帶。說明成功克隆了目標(biāo)片段并插入到pmD-19T載體中，可進行測序分析。

注：第1泳道為2 000 bp DNA Marker;第2泳道為以DNA為模板的PCR產(chǎn)物；第3泳道為PCR回收產(chǎn)物；第4泳道為以重組質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物；第5泳道為插入DNA片段的重組質(zhì)粒；第6泳道為重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；第7泳道為15 000 bp DNA Marker。

2.3 目標(biāo)序列分析

2.3.1 目標(biāo)DNA序列及其目的基因編碼的蛋白質(zhì)序列分析

從自交系Mo17中分離的DNA序列長度為1 534 bp，與玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組(Ref_B73)參考序列GRMZM2G085054的目標(biāo)DNA序列長度相同，但有3處堿基發(fā)生替換突變，并且該DNA序列具有完整的開放閱讀框(ORF)(圖3)。該目標(biāo)DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)序列(bx8Zm5054Mo17P)由459個氨基酸組成，與玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組翻譯的蛋白質(zhì)GRMZM2G085054_P01(簡稱bx8Ref_Zm5054P)相比，存在3處差異，即自N末端起第177個氨基酸由脯氨酸(P)變?yōu)榱涟彼?L)，第281個氨基酸由甘氨酸(G)變?yōu)榫彼?R)，第301個氨基酸由丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T)(圖4)。

圖3 來自玉米自交系Mo17的目標(biāo)DNA序列與標(biāo)準(zhǔn)基因組參考序列的一致性比較

圖4 玉米自交系Mo17的目的基因編碼的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)基因組參考蛋白的氨基酸序列比較

2.3.2 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

2.3.2.1 bx8蛋白的功能預(yù)測

將bx8基因編碼的氨基酸序列導(dǎo)入到NCBI(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫中進行相關(guān)蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。結(jié)果表明,該蛋白有1個保守結(jié)構(gòu)域(圖5)，該結(jié)構(gòu)域位于第6～459位氨基酸之間，屬于Glycosyltransferase_GTB-type超級家族。

圖5 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P保守結(jié)構(gòu)域及其功能

2.3.2.2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

目的蛋白bx8Zm5054Mo17P和參考蛋白bx8Ref_Zm5054P的總元素數(shù)量(表1)分別為6 942和6 917，相對分子量分別為49 601.59和49 456.39。二者在C、H、N、O、S這5種元素構(gòu)成中，除S元素在參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P中的數(shù)量均為19外，其他4種元素含量分別為2 203、3 451、627和642；參考蛋白bx8Ref_Zm5054P序列中分別為2 197、3 436、624和641。并且參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P的親疏水性分別為0.042和0.045，雖然二者的負(fù)電荷殘基總數(shù)均為59，但正電荷殘基總數(shù)相差1個堿基，前者為45個，后者為46個。目的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.24(<40),說明該蛋白穩(wěn)定。

表1 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P的基本理化性質(zhì)

利用在線工具(http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和在線軟件TMHMM Server v.2.0對目的蛋白和參考蛋白的信號肽(圖6)、親疏水性(圖7)和跨膜結(jié)構(gòu)進行分析比對(圖8)。結(jié)果顯示，參考蛋白和目的蛋白均無信號肽，二者親疏水結(jié)構(gòu)極其相似；可以看出該蛋白不屬于轉(zhuǎn)運蛋白和分泌蛋白。且參考蛋白和目的蛋白均為無跨膜區(qū)，所以該蛋白是無信號肽、無跨膜區(qū)的膜內(nèi)蛋白。

圖6 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P的信號肽

注：峰值<0表示親水性，峰值>0表示疏水性。

注：藍(lán)色實線表示伸入到細(xì)胞內(nèi)的部分，粉色實線表示伸入到細(xì)胞膜外的部分。

2.3.2.3 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過使用SOPMA預(yù)測目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)表明(表2)，目的蛋白和參考蛋白均由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲與延伸鏈構(gòu)成，其中，α螺旋與無規(guī)則卷曲占氨基酸總數(shù)的比例較大，在參考蛋白中分別占41.18%與39%，在目的蛋白中分別占41.18%與37.69%，而β轉(zhuǎn)角僅占了6.32%與6.97%。圖9更為直觀地表明參考蛋白和目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)中存在的差異。

利用SWISS-MODEL在線工具預(yù)測參考蛋白和目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)，得到三維結(jié)構(gòu)圖(圖10)。由于目標(biāo)DNA片段編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)基因組上所推斷的蛋白質(zhì)氨基酸序列相比，存在3個氨基酸的差異，導(dǎo)致參考蛋白和目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

表2 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P的二級結(jié)構(gòu)

注：藍(lán)色為α-螺旋；玫紅色為無規(guī)則卷曲；紅色為延伸鏈；綠色為β轉(zhuǎn)角。

圖10 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P的三級結(jié)構(gòu)

2.3.2.4 目標(biāo)基因編碼蛋白bx8Zm5054M017P與其他植物的同源性

來自Mo17的目的蛋白bx8Zm5054Mo17P在NCBI上BLAST結(jié)果見表3。bx8Zm5054Mo17P與玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組推測的登錄號為NP_001144409.2的DIBOA-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶BX8的氨基酸序列一致性達(dá)到99.35%，比對的序列覆蓋率也是100%；與另一個登錄號為AQK48639.1的蛋白質(zhì)氨基酸序列一致性也達(dá)到99.35%，比對的覆蓋率也是100%；與登錄號為BAJ07092.1、XP_020168919.1、BAJ07089.1、AEB61490.1的比對序列覆蓋率均為100%，但比對序列一致性相對較小，低于70%。目的蛋白bx8Zm5054Mo17P與其他植物的蛋白質(zhì)同源性對比見圖11。

表3 目標(biāo)蛋白在NCBI在線BLAST同源性比對

圖11 目的蛋白bx8Zm5054Mo17P與其他植物的蛋白質(zhì)同源性對比

2.3.3 磷酸化位點分析

利用在線工具Net Phos3.1預(yù)測磷酸化位點(圖12)，目的蛋白和參考蛋白中磷酸化位點有25個。其中，Ser有16個，Thr有4個，Tyr有5個。Ser磷酸化位點為Ser73、Ser96、Ser100、Ser209、Ser210、Ser233、Ser274、Ser279、Ser282、Ser319、Ser338、Ser362、Ser368、Ser420、Ser444、Ser458；Thr磷酸化位點為Thr146、Thr189、216、224；Tyr磷酸化位點為Tyr161、Tyr237、Tyr277、Tyr383、Tyr388。

圖12 參考蛋白bx8Ref_Zm5054P和目的蛋白bx8Zm5054Mo17P磷酸化位點

2.3.4bx8蛋白同源性分析及進化樹

在NCBI在線工具下載與bx8高度相似的序列，并利用MEGA7構(gòu)建玉米(Mo17)、普通小麥(Triticum aestivum)、節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii subsp. Strangulata)、黑麥(Secale cereale)、野生二粒小麥(Triticum dicoccoides)、狗尾草(Setaria viridis)、柳枝稷(Panicum virgatum)、黃粟(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)、粳稻(Oryza sativa Japonica Group)、短花稻(Oryza brachyantha)、糙伏毛燕麥(Avena strigosa)、大麥(Hordeum vulgare subsp. Vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的進化樹(圖13)。結(jié)果表明，玉米(Mo17)與其他禾本科植物進化樹分為4支，玉米、普通小麥、節(jié)節(jié)麥和野生二黎小麥為1支；柳枝稷、狗尾草和黃粟為第2支；高粱、粳稻和糙伏毛燕麥為第3支；二穗短柄草、短花稻和大麥為第4支。玉米與普通小麥、節(jié)節(jié)麥和野生二黎小麥的親緣關(guān)系都比較近。

圖13 bx8與其他植物氨基酸序列進化樹

3 討論與結(jié)論

苯并噁嗪代謝，從吲哚-3-甘油磷酸起始，歷經(jīng)吲哚、吲哚-2-酮、3-羥基吲哚-2-酮合成出2-羥基-苯并噁嗪-3-酮(HBOA)；再由HBOA合成出DIBOA。DIBOA在葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的催化下合成出DIBOA-葡萄糖苷后，才能進入下游合成途徑，最終合成出對害蟲具有毒殺作用含甲氧基的各種不同的苯并噁嗪類化合物。所以，DIBOA葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶是苯并噁嗪代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。該研究從玉米的自交系Mo17中克隆到含有目的基因的目標(biāo)DNA片段，長度為1 534 bp；在開放閱讀框(ORF)有3處堿基發(fā)生替換突變。從而造成來自Mo17編碼蛋白的氨基酸序列存在3個氨基酸變異，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的差異變化。雖然來自Mo17的bx8Zm5054Mo17P蛋白質(zhì)分子量和總元素數(shù)量未發(fā)生變化，但其氨基酸序列中存在的3個氨基酸變異，造成了蛋白質(zhì)構(gòu)成元素C、H、N和S組成以及蛋白質(zhì)多肽鏈的正負(fù)電荷量以及親疏水特性等理化特性的略微變化。并且與其他禾本科植物的同源性分析有較高的一致性，說明該蛋白的功能較為保守。屬于Glycosyltransferase_GTB-type 超級家族。

bx8基因存在于禾本科植物的多種作物中，包括玉米、小麥、水稻等[23]，當(dāng)植物遭受外界侵害，bx8基因主要以DIBOA為底物將DIBOA葡萄糖苷化形成DIBOA-Glc而后進入下游的代謝途徑中，從而調(diào)控苯并噁嗪類防御化合物的合成；該研究中克隆的bx8基因所編碼的蛋白質(zhì)，存在3處氨基酸變異導(dǎo)致的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)有兩處發(fā)生變化是否影響玉米抗蟲性的強弱還有待于進一步深入研究。