李 佳， 陳 琦， 林宇青， 張可鑫， 姜 君*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,長(zhǎng)春 130000)

月見(jiàn)草為一年生或多年生柳葉菜科月見(jiàn)草屬植物，其體內(nèi)所含的多種生物活性成分如γ-亞麻酸[1]、脂肪酸[2]、類固醇[3]已被證實(shí)具有抗糖[4]、血脂調(diào)節(jié)[5]、抗血栓[6]等多種功效，月見(jiàn)草黃酮更是一種天然的抗氧化劑，其優(yōu)秀的自由基清除能力被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、美容保健等多個(gè)領(lǐng)域[7]。

閃式提取法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少[8]、提取溶劑用量少[9-10]等優(yōu)點(diǎn)。相較于傳統(tǒng)的溶劑提取，閃式提取儀通過(guò)機(jī)械剪切刀對(duì)藥物進(jìn)行切割，同時(shí)利用超速動(dòng)態(tài)分子的滲透作用，使藥材充分與溶劑作用，能更有效地提取所需活性物質(zhì)[11]。近年來(lái)在多糖、多酚、皂苷、黃酮等多種植物源天然產(chǎn)物的提取工藝研究取得了較大進(jìn)展[12]。曹偉偉對(duì)花生殼中總黃酮的閃式提取條件進(jìn)行篩選，研究得出在最佳提取條件下，花生殼中總黃酮的平均提取率可達(dá)到91.91%[13]，高于熱水回流法及超聲提取法[14]。

該試驗(yàn)探究閃式提取條件對(duì)月見(jiàn)草黃酮提取率的影響，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)比較不同提取條件下的月見(jiàn)草粗提物抗氧化活性，為今后月見(jiàn)草抗氧化產(chǎn)品的工業(yè)化制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月見(jiàn)草全株購(gòu)于亳州大德堂藥業(yè)有限公司；ABTS、過(guò)硫酸鉀購(gòu)于索萊寶科技有限公司；甲醇購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他藥品均購(gòu)于國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 提取時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱取月見(jiàn)草莖、籽粉末10 g分別按液料比1∶30 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶劑于閃式提取器內(nèi)，設(shè)定提取時(shí)間為30、40、50、60、70 s，測(cè)定不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。

2) 溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取月見(jiàn)草莖、籽粉末10 g分別按液料比1∶30 (g∶mL)的比例分別加入60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶劑，提取時(shí)間設(shè)定為之前所選擇的最佳時(shí)間，測(cè)定不同溶劑體積分?jǐn)?shù)下對(duì)黃酮提取率的影響。

3) 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取月見(jiàn)草莖、籽粉末10 g分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g∶mL)的比例加入甲醇溶劑，提取時(shí)間與溶劑濃度均設(shè)置為最佳，測(cè)定不同料液比對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、甲醇濃度、料液比為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，通過(guò)Design-Expert.8.06分析軟件對(duì)月見(jiàn)草黃酮提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平

1.2.3 溶劑搖床法提取月見(jiàn)草莖、籽總黃酮

準(zhǔn)確稱取月見(jiàn)草莖、籽粉末10 g分別按料液比1∶20 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶劑于搖床上提取24 h，過(guò)濾、收集上清液，重復(fù)3次，最終得月見(jiàn)草莖黃酮提取率為67.6 mg/g，月見(jiàn)草籽黃酮提取率為24.7 mg/g。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

參考李靜等[15]的方法并有所改進(jìn)，稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，使用75%乙醇配制成40 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，依次取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于離心管中定容至2 mL，每管依次加入0.3 mL濃度為5%的NaNO2溶液，混勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻靜置6 min，最后加入2.0 mL 4% NaOH溶液，混勻后于510 nm下測(cè)定吸光度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.029 3 C+0.037 2，R2=0.991 8。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算月見(jiàn)草莖、籽粗提物中的總黃酮含量。

1.2.5 月見(jiàn)草莖、籽提取物對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照夏秋霞等[16]的方法并有所改進(jìn)，樣品稀釋為100、50、25、12、6.25 μg/mL，分別取1 mL樣品與等比例0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，以100%甲醇代替樣品做對(duì)照組，混勻后在紫外分光光度計(jì)517 nm處測(cè)量吸光值。

清除率=(對(duì)照組吸光值-樣品組吸光值)/對(duì)照組吸光值×100%

1.2.6 月見(jiàn)草莖、籽提取物對(duì)ABTS自由基清除率的測(cè)定

參照臧永軍等[17]的方法并有所改進(jìn)，將7 mmol/L ABTS與2.45 mM過(guò)硫酸鉀溶液以1∶1的比例混合，避光反應(yīng)16 h，使用時(shí)用無(wú)水乙醇將ABTS儲(chǔ)備液稀釋成OD值為(0.70±0.01)的ABTS工作液。將樣品稀釋至1.00、0.50、0.25、0.13和0.06 mg/mL，依次取0.2 mL于離心管中，每只離心管加入2 mL的ABTS工作液，以不加ABTS工作液的樣品溶液為對(duì)照組、以不加樣品的ABTS工作液為空白組，于紫外分光光度計(jì)734 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算月見(jiàn)草莖、籽提取物對(duì)ABTS自由基的清除率。

清除率=[1-(樣品組吸光值-對(duì)照組吸光值)/空白組吸光值]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可以看出，月見(jiàn)草莖黃酮提取率隨提取時(shí)間、料液比、甲醇濃度的變化先升高后降低，分別在提取時(shí)間50 s、料液比1∶20 (g∶mL)、甲醇濃度70%達(dá)到最大值32.6、53.6和75.6 mg/g。推測(cè)隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)械發(fā)熱產(chǎn)生的熱量使樣品中黃酮在高溫下受到一定程度的破壞導(dǎo)致提取率下降；而料液比和甲醇濃度的升高也使樣品中其他可溶物對(duì)黃酮產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制，影響了黃酮提取率。

注：圖中不同字母表示同一因素不同處理?xiàng)l件間差異顯著，即P<0.05，下同

由圖2可以看出，當(dāng)月見(jiàn)草籽提取時(shí)間達(dá)到60 s時(shí)，總黃酮提取率最高，達(dá)到11.6 mg/g；隨著料液比的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，并于料液比1∶20時(shí)達(dá)到最大值15.4 mg/g；甲醇濃度為70%時(shí)，月見(jiàn)草籽中的黃酮提取率顯著高于其它處理組，為26.7 mg/g。因此，選擇提取時(shí)間60 s，料液比1∶20，甲醇濃度70%為響應(yīng)面優(yōu)化因素。

圖2 提取時(shí)間(A)、料液比(B)、甲醇濃度(C)對(duì)月見(jiàn)草種子提取物中總黃酮產(chǎn)率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)月見(jiàn)草莖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 月見(jiàn)草莖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行擬合分析，從而得到總黃酮得率的提取時(shí)間(A)、料液比(B)及甲醇濃度(C)編碼值的二次回歸模型方程。

總黃酮得率=+73.99+2.08A+0.967 5B+0.627 5C+1.14AB-0.305 0AC-0.195 0BC-2.39A2+0.412 5B2-2.28C2

由月見(jiàn)草莖方差分析結(jié)果可知，該模型回歸顯著(P<0.01)失擬項(xiàng)(P=0.073 6)不顯著，表明自變量與響應(yīng)值之間的模型關(guān)系顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合良好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)月見(jiàn)草莖總黃酮得率的提取結(jié)果。

由軟件分析各因素對(duì)月見(jiàn)草莖總黃酮提取率影響的二維等高線圖及三維響應(yīng)曲面圖如圖3所示，當(dāng)提取液濃度取零點(diǎn)值時(shí)，提取時(shí)間與料液比兩者之間相互影響不顯著，兩者之間的等高線呈現(xiàn)不規(guī)則形；由效應(yīng)面的陡峭程度可判斷出提取時(shí)間與料液比交互作用顯著；當(dāng)提取時(shí)間取零點(diǎn)值時(shí)，甲醇濃度與料液比之間的二維等高線無(wú)閉合，說(shuō)明二者之間交互作用不顯著，結(jié)果與方差分析結(jié)果相符。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)月見(jiàn)草籽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 月見(jiàn)草種子提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行擬合分析，從而得到總黃酮量提取時(shí)間(A)、料液比(B)及甲醇濃度(C)編碼值的二次回歸模型方程，由方差分析結(jié)果得總黃酮得率=+25.72+0.548 8A-0.011 9B-1.09C-1.02AB-2.23AC+0.071 3BC-2.39A2-1.49B2-1.73 C2

由軟件分析各因素對(duì)月見(jiàn)草籽總黃酮提取率影響的二維等高線圖及三維響應(yīng)曲面圖如圖4所示，由效應(yīng)面的陡峭程度可判斷出提取時(shí)間與甲醇濃度交互作用顯著，提取時(shí)間與料液比、甲醇濃度與料液比的交互影響不顯著，與方差分析結(jié)果相符。

圖3 月見(jiàn)草莖提取的響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖

2.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證

擬合的最優(yōu)結(jié)果及結(jié)果驗(yàn)證如表4～5所示，由于時(shí)間無(wú)法精準(zhǔn)把控，故在實(shí)際工藝上進(jìn)行了調(diào)整。最終月見(jiàn)草莖在提取時(shí)間50 s、料液比1∶19.4 (g∶mL)、甲醇濃度68%時(shí)黃酮提取率為75.6 mg/g；月見(jiàn)草籽在提取時(shí)間61 s、料液比1∶20.3 (g∶mL)、甲醇濃度71%時(shí)黃酮提取率達(dá)到25.8 mg/g，遠(yuǎn)優(yōu)于搖床法。

圖4 月見(jiàn)草種子提取的響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖

表4 月見(jiàn)草莖提取的響應(yīng)面分析結(jié)果的驗(yàn)證

表5 月見(jiàn)草種子提取的響應(yīng)面分析結(jié)果的驗(yàn)證

2.4 月見(jiàn)草莖、籽提取物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

不同濃度與不同提取工藝的月見(jiàn)草莖提取物清除DPPH自由基能力如圖5所示。從圖5可以看出，月見(jiàn)草莖提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨濃度升高而增加，閃式提取法清除能力略低于VC，遠(yuǎn)高于搖床法，高濃度下幾乎與VC持平；說(shuō)明在這一濃度下，閃式提取法的月見(jiàn)草莖提取物有著較好的DPPH自由基清除率。

圖5 月見(jiàn)草莖提取物對(duì)DPPH自由基清除活性的影響

不同濃度與不同提取工藝的月見(jiàn)草籽提取物清除DPPH自由基能力如圖6所示。由圖6可知，月見(jiàn)草籽提取物有一定的DPPH清除能力，但低濃度表現(xiàn)不佳，與VC之間仍有差距；其中，閃式提取法的月見(jiàn)草籽提取物對(duì)DPPH的清除能力最佳，遠(yuǎn)高于搖床提取。高濃度的月見(jiàn)草籽提取物或可用以替代VC的DPPH清除作用。

圖6 月見(jiàn)草種子提取物對(duì)DPPH自由基清除活性的影響

2.4.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

由圖7可知，VC和月見(jiàn)草莖提取物對(duì)ABTS自由基均表現(xiàn)出良好的清除能力，且呈量效關(guān)系，閃式提取法所得提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力略低于VC，略高于搖床法。2種提取方法下的提取物ABTS自由基清除力基本持平，說(shuō)明搖床法并不會(huì)過(guò)多損傷月見(jiàn)草莖的ABTS自由基清除能力。

圖7 月見(jiàn)草莖提取物對(duì)ABTS自由基清除活性的影響

由圖8可知，月見(jiàn)草籽提取物的對(duì)ABTS自由基有一定的清除力，且隨著質(zhì)量濃度的升高也在不斷增強(qiáng)，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)、高濃度下閃式提取法與搖床法對(duì)ABTS自由基的清除力幾乎一致，但仍然低于對(duì)照品VC的清除力。

圖8 月見(jiàn)草種子提取物對(duì)ABTS自由基清除活性的影響

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，植物有效物質(zhì)的提取主要有水提法、有機(jī)溶劑提取法、酶提法和超聲波輔助提取法，但普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)、耗材量大、提取效率低、產(chǎn)物活性差等種種弊端[18]。閃式提取作為一種新興提取方式，利用負(fù)壓滲透作用和高速剪切作用，促進(jìn)植物細(xì)胞快速破壁粉碎，在短時(shí)間內(nèi)使植物組織與提取溶劑充分作用，耗時(shí)更短、提取效率更高、能最大限度保護(hù)植物有效成分[19]。

而響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，借以推測(cè)出閃式提取月見(jiàn)草莖、籽黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)：當(dāng)提取條件為提取時(shí)間50.32 s，料液比1∶19.4 (g∶mL)，甲醇濃度68%時(shí)月見(jiàn)草莖的總黃酮提取率為76.8 mg/g，當(dāng)提取條件為提取時(shí)間60.72 s，料液比1∶20.3 (g∶mL)，甲醇濃度71%時(shí)月見(jiàn)草籽的總黃酮提取率為27.1 mg/g，顯著高于其它提取條件所得總黃酮[20]。且經(jīng)該提取方法所得粗提物已被驗(yàn)證有較好的抗氧化活性[21-22]，為其在食品、藥品等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。