曲庭偉， 張文璇， 崔春梅， 姜人月， 鮑君鐸， 趙仁雙， 金 鑫*

(1.延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.上海市銳翌生物科技有限公司，上海201199)

氣腫疽病，也稱為黑腿病，“黑腿”即為氣腫疽梭菌所引起的較為明顯的臨床癥狀，嚴格來講，該病典型臨床癥狀為患病動物豐滿肌肉部位發(fā)炎、腫脹，施力觸壓時可聽到類似捻發(fā)音[1]。該病常呈急性發(fā)病，潛伏期較短，病情發(fā)展迅速，甚至有一些動物在未出現(xiàn)明顯癥狀時便死亡[2]。已經(jīng)患有此病的動物和帶菌動物是該病最主要的傳染源，如患病動物的排泄物，或者外傷，都會造成食物、土壤、草料、飲水等的污染，從而導致該病的傳播[1]。病原菌侵入機體的具體經(jīng)過尚未有明確的闡述，但目前已知其主要的入侵途徑有2種：1) 是經(jīng)消化道黏膜破潰侵入機體；2) 進入血液后隨血流到達機體內(nèi)部造成感染[2]。經(jīng)多位國外學者進行研究發(fā)現(xiàn)，氣腫疽梭菌有以下幾種毒力因子：細胞毒素CctA、鞭毛蛋白FliA、唾液酸酶NanA[3-6]，此外，2017年Saroj K等研究表明，氣腫疽梭菌的基因組中含有2種不同的透明質(zhì)酸酶基因，可降解宿主體內(nèi)稱為透明質(zhì)酸的結締組織，即NagH和NagJ[7]，并證明透明質(zhì)酸酶參與降解細胞內(nèi)基質(zhì)和組織連接，從而使氣腫疽梭菌及其毒素能夠在感染的宿主中傳播[7]。

氣腫疽病病程發(fā)展較快，主要預防手段為定期注射疫苗[8]。其中，核酸疫苗較普通疫苗有免疫保護力強，免疫保護力較持久，易于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點[9]。根據(jù)前人成功試驗經(jīng)驗[10-12]，將pVAX1選做該次試驗的表達載體，pVAX1作為哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中高效表達目的基因的表達載體,大小為3.0 kb,是基于pcDNA3.1上重建得到的新型真核表達載體,用卡那抗性代替安芐抗性篩選基因,能有效降低人類基因組重組的可能,且pVAX1載體為非融合載體,其產(chǎn)生的蛋白在結構和功能上與天然存在的蛋白質(zhì)幾乎相同[13]。故該試驗以氣腫疽梭菌NagH基因和pVAX1載體為基礎，構建pVAX1-NagH真核表達質(zhì)粒，對BALB/c小鼠肌肉注射pVAX1-NagH核酸疫苗，以觀察該核酸疫苗是否會誘導小鼠產(chǎn)生免疫應答。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞

延邊株氣腫疽梭菌、pVAX1載體、Vero細胞均于延邊大學動物醫(yī)學預防實驗室保存。

1.2 主要試劑及引物

1.2.1 主要試劑

pMD18-T Simple載體，連接緩沖液SolutionI，購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；質(zhì)粒無內(nèi)毒素DNA大量提取試劑盒，購自上海萊楓生物技術有限公司；Mouse IgG1 ELISA KIT、Mouse IgG2a ELISA KIT、Mouse IL-4 ELISA Kit、Mouse IFN-γELISA Kit，購自杭州聯(lián)科生物有限公司；LipofectamineTM6 000，購自上海碧云天生物技術有限公司；FITCRat Anti-Mouse IgG,購自艾美捷科技；DMEM低糖培養(yǎng)基(含葡萄糖，HEPES,青霉素和鏈霉素)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 引物

為了方便后期真核表達載體的構建，在上游添加了Kozak序列(加粗部分)(表1)。

表1 引物核苷酸序列

1.3 實驗動物

5周齡雌性BALB/c小鼠，24只，購自吉林億斯實驗動物中心。

1.4 方法

1.4.1 pVAX1-NagH真核表達載體的構建

對PCR陽性產(chǎn)物進行凝膠回收，并將凝膠回收產(chǎn)物與pVAX1載體連接。按照如下體系混和：目的基因NagH片段4 μL,載體1 μL,連接緩沖液Solution I 10 μL；16 ℃連接12 h；將連接物轉化至50 μLTrans5α感受態(tài)細胞中，使用涂布棒，在超凈工作臺中將其均勻涂布在含有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取平板上清晰單個菌落，接種到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩過夜，次日提取連接物的質(zhì)粒，所得質(zhì)粒進行PCR鑒定，并將鑒定為陽性的產(chǎn)物送往哈爾濱擎科嘉美生物科技有限責任公司進行測序。將測序正確的質(zhì)粒保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4.2 重組質(zhì)粒pVAX1-NagH的表達分析

1.4.2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-NagH的轉染

在DMEM無雙抗培養(yǎng)液中加入生長狀態(tài)良好的Vero細胞進行傳代，并將細胞轉移至24孔細胞培養(yǎng)板中，在細胞生長至約鋪滿80%板底的時候進行轉染。取3 μL LipofectamineTM6 000和97 μLOpti-MEM培養(yǎng)液混合均勻，制備成混合液1；取10 μL pVAX1-NagH質(zhì)粒與90 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，制備成混合液2，混合均勻后靜置5 min。將混合液1和混合液2混勻后室溫靜置30 min。將DMEM無雙抗培養(yǎng)液換成Opti-MEM培養(yǎng)液，對24孔板中的Vero細胞清洗2次。每孔加入500 μL的培養(yǎng)液(Opti-MEM), 37 ℃培養(yǎng)5 h后棄廢液，最后在每孔中加1.5 mL DMEM低糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。

1.4.2.2 IFAT檢測NagH基因的表達

在轉染后，丟棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10%冷丙酮，固定10 min，再次用PBS緩沖液清洗2次，向各孔中加入500 μL稀釋后的一抗(鼠抗氣腫疽梭菌NagH)，37 ℃靜置90 min，用PBS緩沖液清洗3次。再向各孔中加500 μL稀釋后的二抗(FITCRat Anti-Mouse IgG),37 ℃靜置60 min，最后用PBS清洗3次。在熒光倒置顯微鏡下觀察結果。

1.4.3 動物試驗

24只5周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為pVAX1-NagH組，pVAX1組，PBS組進行免疫，該試驗采用雙側股四頭肌注射法進行免疫，方法為每間隔14 d免疫1次；分別在1免(0 d)前，2免(14 d)前，3免(28 d)前和所有免疫結束后進行尾靜脈采血，分離血清。免疫策略見表2。

1.4.3.1 檢測小鼠血清中IgG的指標水平

取100 μL用ELISA包被液(碳酸鹽緩沖溶液)稀釋的NagH抗原(25 μg/mL)加入到96孔板中，4 ℃靜置過夜；棄廢液后每孔加入150 μL PBST進行洗板，每5 min重復1次，共重復3次；使用含2%脫脂乳的PBST封閉液，進行封閉，37 ℃避光靜置2 h；將待測血清100倍稀釋后，每孔加100 μL,37 ℃避光靜置1 h，結束后進行3次洗板；將HRP Rat Anti-Mouse IgG與PBS緩沖液按照1∶5 000的比例混合稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃避光靜置1 h，結束后進行3次洗板；每孔加100 μL OPD顯色液，室溫避光15 min；每孔加50 μL終止液，參考以往成功試驗[10-11]的酶標儀波長條件，使用酶標儀在450 nm波長條件下測定其OD值。

1.4.3.2 檢測小鼠血清中IgG1、IgG2a、IFN-γ、IL-4的指標水平

按照相應ELISA檢測試劑盒說明書中的步驟進行操作，檢測小鼠血清中IgG1、IgG2a、IFN-γ、IL-4水平。

1.4.4 統(tǒng)計學方法

該試驗采用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 IFAT檢測NagH基因的表達

轉染后進行間接免疫熒光檢測，結果顯示轉染了質(zhì)粒的Vero細胞在顯微鏡下有綠色熒光出現(xiàn)，而另外2組細胞在鏡下均無熒光。說明pVAX1-NagH質(zhì)粒中的NagH基因能夠在Vero細胞中穩(wěn)定表達(圖1)。

A: pVAX1-NagH(200×); B: pVAX1對照組(200×); C: 正常細胞對照組(200×)

2.2 免疫效果評價

2.2.1 小鼠血清中IgG指標變化

應用間接ELISA檢測方法來測定血清中IgG水平，可見pVAX1-NagH組在第1次免疫后，抗體水平持續(xù)上升，且顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組免疫小鼠血清中IgG指標變化

2.2.2 小鼠血清中IgG1指標變化

Mouse IgG1 ELISA KIT檢測小鼠血清IgG1水平。可見pVAX1-NagH組在免疫后的抗體水平總體呈上升趨勢，雖然在第3次免疫后上升趨勢并不顯著，但始終顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 各組免疫小鼠血清中IgG1指標變化

2.2.3 小鼠血清中IgG2a指標變化

Mouse IgG2a ELISA KIT檢測小鼠血清IgG2a水平?？梢妏VAX1-NagH組在免疫后的抗體水平顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1載體組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 各組免疫小鼠血清中IgG2a指標變化

2.2.4 小鼠血清中IFN-γ指標變化

Mouse IFN-γELISA KIT檢測小鼠血清IFN-γ水平?？梢妏VAX1-NagH組在免疫后的抗體水平在免疫后的前28 d中呈現(xiàn)上升趨勢，且顯著高于pVAX1組和PBS組(P<0.05)，但其抗體水平在第4次檢測時未能維持在最高水平，而呈現(xiàn)了下降趨勢。pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖5 各組免疫小鼠血清中IFN-γ指標變化

2.2.5 小鼠血清中IL-4指標變化

Mouse IL-4 ELISA KIT檢測小鼠血清IL-4水平?？梢妏VAX1-NagH組在免疫后的抗體水平顯著高于其他2組(P<0.05)，而pVAX1組和PBS組之間則無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 各組免疫小鼠血清中IL-4指標變化

3 討論與結論

近年來，我國對氣腫疽疾病的控制已經(jīng)達到良好成效，在預防方面做了充分準備，定期注射疫苗，加強衛(wèi)生治理，減少體表創(chuàng)傷，提高畜舍管理水平[8]。免疫是機體的一種特異性生理反應, 通過識別和排除抗原性異物維持體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。動物機體的免疫功能是在淋巴細胞和其他有關細胞及產(chǎn)物的相互作用下完成的, 這些具有免疫作用的細胞及產(chǎn)物以及與其相關的組織和器官, 構成了機體的免疫系統(tǒng)[14]。在引物設計過程中，參考以往成功試驗[9,15]，加入了Kozak序列，增強了翻譯的效率。在注射疫苗時，采用了雙側股四頭肌注射法進行免疫，據(jù)稱，肌肉注射DNA比其他組織攝取DNA的效率高100～1 000倍, 故該試驗采用雙側股四頭肌注射法進行免疫[16]。

在機體免疫過程中,Th1細胞主要參與細胞免疫應答,殺滅細菌和病毒等病原體,主要生產(chǎn)IFN-γ, IL-2和TNF-β等[17]，其通過刺激B細胞的增殖分化,在IFN-γ的輔助作用下促進IgG2a的產(chǎn)生,而Th2主要參與體液免疫應答在變態(tài)反應性疾病中發(fā)揮作用,主要產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-10等[18]，其在IL-4的輔助作用下促進IgG1的產(chǎn)生,Th1和Th2通過相互協(xié)調(diào)作用,共同完成機體的免疫調(diào)節(jié)[17-20]。該試驗通過檢測IFN-γ、IgG2a作為Th1細胞免疫水平的依據(jù),通過檢測IL-4、IgG1水平作為體液免疫水平的依據(jù)。

結果顯示在接受了免疫接種后，通過對血清抗體含量的分析發(fā)現(xiàn)，各組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的免疫反應。其中，pVAX1-NagH免疫組的小鼠血清抗體水平逐漸上升，且IgG1與IgG2a水平高于pVAX1空載體組和PBS對照組，IFN-γ和IL-4細胞因子水平高于pVAX1空載體組和PBS對照組，IgG1、IgG2a、IL-4和IFN-γ指標在小鼠血清中的水平不但與對照組形成顯著差異，而且在最后一次接種后2周的時間里能夠始終保持在較高水平。說明pVAX1-NagH疫苗組明顯能夠誘導機體產(chǎn)生良好的免疫應答。但根據(jù)第42天的檢測結果顯示，IFN-γ的水平出現(xiàn)了一定程度的下降，該情況的出現(xiàn)可能由多種原因導致，這可能顯示著該重組質(zhì)粒不能很好地引起小鼠血清中IFN-γ水平的升高，對細胞免疫效果并未達到理想狀態(tài)。就此次試驗而言，亦不能完全排除飼養(yǎng)等人為因素造成一定誤差的可能。

根據(jù)以往成功試驗結果[10-11,21]，分析可得NagH的核酸疫苗免疫效果與FliA、NanA和CctA的免疫效果趨勢相近，說明NagH與FliA、NanA、CctA同樣可以起到刺激小鼠免疫反應的作用，在預防氣腫疽梭菌疾病和維護公共衛(wèi)生安全方面更進一步。