劉艷嬌，李淑紅，白利穎，曹冬焱，楊佳欣，沈 鏗，孫恒子**

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100020；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730)

近年來，隨著三孩政策開放及篩查手段的提高，妊娠合并宮頸病變也被更多的發(fā)現(xiàn)并引起更多的關(guān)注。根據(jù)我國《妊娠合并子宮頸癌管理的專家共識》[1]，當細胞學為意義不明的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASC-US)且高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)檢測陽性者低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL),不典型鱗狀細胞傾向上皮內(nèi)高度病變(atypical squamous cells not except high lesion,ASC-H)及高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及以上病變者應轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，根據(jù)檢查情況行宮頸活檢。然而，約48%～86%的妊娠期宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變能自然消退[2-3]。子宮頸癌篩查的研究顯示，聯(lián)合檢測有效提高了宮頸癌篩查的有效性，但仍有超過60%的患者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，但病理結(jié)果提示組織學LSIL及以下[4]。孕期反復陰道鏡檢查可能增加患者的焦慮和擔憂，降低患者的依從性[5]。因此，探索更多的妊娠期持續(xù)組織學HSIL高危標志物，以提高診斷的準確性并降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率是妊娠期宮頸癌防治工作中亟待解決的問題之一。

近年來，細胞學p16/Ki-67雙染被提議作為陰道鏡分流的生物標志物。然而，Ciavattini等[6]研究認為，妊娠期特殊的激素水平和生理環(huán)境可干擾參與細胞周期調(diào)控的蛋白表達，導致p16/Ki67染色陽性與宮頸病變的相關(guān)性差于非妊娠期，影響結(jié)果的判定。p16/Ki67染色在妊娠期宮頸病變中的應用價值尚需更多循證學依據(jù)。我們既往研究顯示，p16聯(lián)合細胞形態(tài)及HPV感染相關(guān)標記物SMAD3、YAP1、RELA高表達檢出組織學HSIL較p16/Ki-67具有更高的靈敏度和特異性，提示p16與SMAD3、YAP1、RELA可能與宮頸上皮內(nèi)病變進展密切相關(guān)[7]。本研究擬評估p16、Ki-67與細胞形態(tài)及HPV感染相關(guān)基因SMAD3、YAP1、RELA的表達與妊娠期宮頸病變轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，探索妊娠期持續(xù)組織學HSIL相關(guān)高危標志物，以期為妊娠期宮頸病變患者提供更精準的臨床診療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2020年1月于首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院及中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院確認妊娠并定期產(chǎn)檢的患者。嚴格篩選妊娠建檔后行細胞學及HPV檢查，納入檢查結(jié)果異常轉(zhuǎn)診陰道鏡并行宮頸活檢的患者作為研究對象。納入標準：(1)妊娠前從未行HPV及TCT檢查或妊娠前末次檢查(1年以上)結(jié)果無異常；(2)孕期產(chǎn)檢TCT異常和(或)高危型HPV陽性；(3)孕期陰道鏡檢查可疑，簽署知情同意書后行宮頸活檢病理檢查。排除標準：(1)合并免疫缺陷、嚴重肝腎功能異常、嚴重全身系統(tǒng)性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前終止妊娠者；(3)宮頸病變篩查與宮頸活檢間隔超過6個月；(4)宮頸活檢組織不足，無法完成后續(xù)研究要求者。收集患者的一般資料、孕產(chǎn)次、TCT及HPV結(jié)果、陰道鏡病理等結(jié)果。排除標準：(1)合并免疫缺陷、嚴重肝腎功能異常、嚴重全身系統(tǒng)性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前終止妊娠者；(3)宮頸病變篩查與宮頸活檢間隔超過6個月；(4)宮頸活檢組織不足，無法完成后續(xù)研究要求者。

1.2 研究方法 復核入組患者陰道鏡病理后取活檢病理蠟塊切片4μm，梯度二甲苯脫蠟及乙醇水洗，沖洗切片3次。將洗后切片置于pH 9.0的EDTA中，置微波爐中加熱至沸騰，冷卻5min，重復4次，修復完畢后冷卻至室溫。3%過氧化氫液，37℃孵育10min。沖洗切片3次。滴加山羊血清封閉液，37℃濕盒中孵育10min，吸水紙吸干。滴加稀釋后一抗，4℃孵育過夜，沖洗切片3次。37℃濕盒孵育1h。沖洗切片3次。孵育二抗30min。沖洗切片3次。滴加DAB顯色液，蒸餾水沖洗。蘇木素復染60s，蒸餾水沖洗。鹽酸酒精分化2s，蒸餾水沖洗。脫水，透明及中性樹脂封片。研究中抗體均購自美國Abcam公司。一抗的濃度：p16(1∶1000)、Ki-67(1∶1000)、SMAD3(1∶2000)、YAP1(1∶1000)和RELA(1∶2000)。PBS溶液為陰性對照。

1.3 結(jié)果判讀 根據(jù)LAST中HPV相關(guān)病變的標準化方案(The Lower Anogenital Squamous Terminology Standardization project for HPV-associated lesions)[8]，p16陽性染色被定義為基底細胞層的持續(xù)強核或核+細胞質(zhì)染色，向上延伸至少涉及三分之一上皮層。其他染色類型如僅細胞質(zhì)、斑點狀、水坑狀、散在或單細胞陽性為陰性染色。Ki-67、SMAD3、YAP1和RELA陽性染色判定[7]：選擇5個隨機顯微鏡視野來評估半定量染色。免疫組化染色強度:+，弱(1分)；++，中等(2分)；+++，強(3分)。每個視野中陽性鱗狀上皮細胞面積:+，0%～33%(1分)；++，33%～66%(2分)；+++，66%～100%(3分)。將免疫組化染色強度得分及染色陽性面積得分2個分數(shù)乘積后再乘以常數(shù)5得到5到45之間的染色總評分。0～17分：低表達(-)，18～45分：高表達(+)。對于陽性細胞的數(shù)量沒有明確的定量標準。判讀由兩位病理科醫(yī)師獨立進行，判讀結(jié)果不一致時由第三位病理科醫(yī)師判讀。

1.4 隨訪 收集患者產(chǎn)后6～12周復查TCT及HPV結(jié)果，異常結(jié)果行陰道鏡活檢者，追訪患者活檢病理結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件，分子標記物表達與宮頸病變之間的相關(guān)性采用卡方檢驗(Fisher精確檢驗)。采用敏感度、特異度、約登指數(shù)和ROC曲線下面積(Area Under Curve,AUC)等指標評價診斷試驗效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 入組患者一般資料 患者年齡為21～42歲，中位年齡為33歲。患者產(chǎn)前TCT結(jié)果：ASCUS合并高危HPV陽性患者28例，LSIL患者44例，ASC-H患者8例，HSIL患者42例。陰道鏡活檢病理為組織學LSIL及以下病變者共60例，其中包括宮頸良性病變24例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ 36例；組織學HSIL病變共62例，其中包括CINⅡ 42例，CINⅢ 19例以及原位癌1例。見表1。

表1 入組患者孕期聯(lián)合篩查及活檢病理結(jié)果

2.2 相關(guān)分子標志物在不同宮頸病變中的表達 免疫組化結(jié)果顯示，62例組織學HSIL中，p16高表達(p16+)共42例，Ki-67高表達(Ki-67+)共30例，SMAD3高表達(SMAD3+)共24例，YAP1高表達(YAP1+)共27例，RELA高表達(RELA+)共38例；60例組織學LSIL中，p16+共14例，Ki-67+共11例，SMAD3+共17例，YAP1+共9例，RELA+共12例。組織學HSIL中p16(P<0.001)、Ki-67(P=0.004)、YAP1(P<0.001)和RELA(P<0.001)表達均明顯高于組織學LSIL及以下病變；SMAD3在不同病變的表達無明顯差異(P=0.225)。見圖1。

2.3 聯(lián)合分子標志物診斷產(chǎn)后高級別上皮內(nèi)病變的效能評價 產(chǎn)后6～12周內(nèi)共109例患者再次行聯(lián)合篩查，其中86例患者再次行陰道鏡檢查活檢，病理結(jié)果為組織學HSIL病變?yōu)?5例，其中CINⅡ 33例(5例由孕期組織學LSIL進展為CINⅡ，9例由孕期組織學CINⅢ消退為CINⅡ，16例孕期組織學CINⅡ消退為LSIL及以下)，CINⅢ 12例(2例由CINⅡ進展為CINⅢ)，HSIL自然消退率為47.5%。聯(lián)合免疫組化分析，結(jié)果顯示單獨p16+診斷產(chǎn)后組織學HSIL較p16+聯(lián)合Ki-67+具有更高的敏感度(68.9% vs 26.7%，P<0.001)，但特異度較低(65.6% vs 84.4%，P=0.014)；p16+聯(lián)合RELA+較p16+聯(lián)合Ki-67+具有相當?shù)奶禺惗?89.1% vs 84.4%，P=0.435)，但敏感度較低(57.8% vs 26.7%，P=0.003)；p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+較單獨p16+具有相當?shù)拿舾卸?66.7% vs 68.9%，P=0.822)及更高的特異度(84.4% vs 65.6%，P=0.014)。p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+具有最高的約登指數(shù)0.510。見表2。ROC曲線提示p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+診斷產(chǎn)后組織學HSIL具有最大曲線下面積0.747(95%CI=0.650～0.845)。見表2、圖2。

表2 聯(lián)合分子標志物診斷產(chǎn)后高級別上皮內(nèi)病變的效能評價

3 討 論

隨著我國三孩政策的開放，孕產(chǎn)婦總?cè)藬?shù)及高危孕產(chǎn)婦比例升高，妊娠合并宮頸癌發(fā)病也將呈上升趨勢。研究顯示，妊娠期組織學確診的HSIL仍具有較高的自然轉(zhuǎn)歸率，然而其原因仍不清。

Ahdoot等[9]研究認為，孕期多次行宮頸活檢，導致部分或全部病灶被去除，從而使產(chǎn)后病變自然轉(zhuǎn)陰率提高。此外，一些研究認為，在陰道鏡活檢過程中宮頸上皮完整性的破壞可能引發(fā)局部免疫反應，導致病灶的轉(zhuǎn)歸[3]。分娩方式對妊娠期HSIL的轉(zhuǎn)歸影響仍存在爭議。一些學者發(fā)現(xiàn)，陰道分娩較剖宮產(chǎn)具有更高的轉(zhuǎn)歸率(67% vs 13%)[10]。Para等[11]認為，其機制可能是宮頸創(chuàng)傷，尤其是在分娩過程中發(fā)生的創(chuàng)傷可能導致宮頸上皮的炎癥反應，或?qū)m頸成熟過程中發(fā)育不良的宮頸上皮丟失，以及胎兒通過產(chǎn)道的過程導致病變處的宮頸上皮受損修復過程中被正常上皮所替代所致。另外，陰道分娩期間的短暫缺血性變化可能與產(chǎn)后宮頸病變的消退相關(guān)[12]。近年來，也有部分研究并未發(fā)現(xiàn)分娩方式與產(chǎn)后宮頸病變的轉(zhuǎn)歸之間存在任何關(guān)聯(lián)[13]。其認為妊娠特殊的激素水平導致孕婦免疫力降低，因此孕期易導致HPV感染及宮頸病變，并根據(jù)孕期與非孕期宮頸病變病灶中Ki-67表達差異推測妊娠期特殊的激素水平及免疫機制可能影響細胞周期調(diào)控蛋白的表達從而干擾高危HPV誘導的致癌過程，進而干擾病變進展。另一方面，由于產(chǎn)后激素水平和免疫力的恢復，產(chǎn)婦HPV感染逐漸轉(zhuǎn)陰，使妊娠期宮頸病變自然消退率增加[6，13]。

目前關(guān)于妊娠期宮頸上皮內(nèi)病變高危標志物的研究仍較少，妊娠期行陰道鏡活檢的獲益可能仍較低。本研究中妊娠期HPV及TCT篩查結(jié)果異常后行陰道鏡活檢檢出組織學HSIL為50.8%。因此，有必要探索有效的標志物，以避免過度診療和不必要的侵入性檢查。

p16基因產(chǎn)物是一種細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑，持續(xù)性HPV感染伴隨的細胞異常增生會導致p16過表達。Galgano等報告，p16免疫染色檢出組織學HSIL的敏感度為86.7%,特異度為82.8%[14]。Ki-67是一種標志細胞增殖的核抗原。在正常細胞中，p16和Ki67表達相互拮抗，p16與Ki67同時過表達提示細胞周期調(diào)控失衡，存在病變。LAST指南中提議，H&E染色形態(tài)學鑒別存在爭議時，可進一步行p16染色以提高HSIL診斷的一致性。p16陽性的CINⅡ建議歸為HSIL，p16/Ki67陰性的CINⅡ建議歸為LSIL[8]。

SMAD3是一種介導多種信號通路的信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在癌癥發(fā)生的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。最近的研究表明，Twist在宮頸癌發(fā)生過程中通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，并且TGF-β/Smad3信號的激活可誘導宮頸癌細胞系的遷移和侵襲[15]。YAP1編碼Hippo信號通路的下游核內(nèi)效應器，參與發(fā)育、生長、修復和體內(nèi)平衡。YAP1蛋白在浸潤性宮頸癌和宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變中均上調(diào)，YAP1與HPV感染相關(guān)，HPV E6蛋白可抑制YAP1蛋白的降解，HPV E7蛋白通過靶向PTPN14促進YAP1蛋白在細胞核中的表達。HPV E6/E7誘導的YAP1蛋白積累及其釋放到細胞核的組合導致YAP1的劇烈活化，這可能是其促進宮頸上皮細胞增殖并最終導致宮頸癌變的機制[16-17]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)與許多癌癥的發(fā)病機制有關(guān)，其在細胞增殖、遷移、血管生成和凋亡多種基因功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RELA是NF-κB1基因的產(chǎn)物并與該基因復合形成NF-κB最豐富的形式。而HPV感染能促進RELA表達增加，HPV16通過HPV E6/E7癌基因的過表達及其與NF-κB的功能相互作用促進HPV所致腫瘤的進展及分化，且RELA過表達與宮頸腫瘤的進展相關(guān)[18-19]。最近，有研究者通過系統(tǒng)分析細胞形態(tài)相關(guān)基因與關(guān)鍵EMT轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，證實SMAD3、RELA和YAP1在細胞形態(tài)信息傳感方面發(fā)揮了重要作用[20]。

既往對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的研究發(fā)現(xiàn)，p16聯(lián)合SMAD3/RELA/YAP1的高表達在檢出組織學HSIL中具有良好的敏感度和特異度[7]。本研究結(jié)果顯示，在妊娠期宮頸上皮內(nèi)病變中除SMAD3外，p16等在宮頸高級別上皮內(nèi)病變中的表達明顯升高，且p16+聯(lián)合RELA+和(或)YAP1+較p16+、Ki-67+在診斷產(chǎn)后組織學HSIL中同時具有更高的敏感度及特異度，且具有最大ROC曲線下面積，在診斷妊娠期持續(xù)組織學HSIL中具有更好的效能。推測可能是由于持續(xù)HPV感染導致妊娠期宮頸病變中p16過表達。而YAP1、RELA與HPV感染所致宮頸病變的進展密切相關(guān)，更重要的是，兩者均在病變細胞形態(tài)改變過程中發(fā)揮重要作用。因此，p16聯(lián)合RELA和(或)YAP1的異常表達，能從分子水平反應出妊娠期持續(xù)性HPV感染引起的宮頸上皮細胞周期表達異常及細胞形態(tài)的改變，提示病變有進展可能，從而提高診斷的敏感度及特異度。而病灶中Ki-67的表達受妊娠期特殊的激素水平及免疫機制的影響無法準確反應出病變進展的情況。然而，對p16、YAP1及RELA對妊娠期宮頸病變進展的影響機制仍需更進一步的探索。

本研究通過對陰道鏡活檢病理免疫組化染色，探索對妊娠期宮頸病變持續(xù)存在或進展有提示意義的標志物，以提高對持續(xù)性宮頸高級別上皮內(nèi)病變的檢出率，降低大部分能夠自然轉(zhuǎn)歸產(chǎn)婦在孕期行陰道鏡檢查的頻率。另一方面，為后續(xù)在妊娠期宮頸脫落細胞中相關(guān)標志物的研究提供理論基礎，以期探索可以應用于陰道鏡轉(zhuǎn)診前的分流方案。綜上所述，妊娠合并高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者約半數(shù)以上可自然消退，p16、YAP1及RELA高表達對持續(xù)組織學HSIL有較高的診斷價值，但仍需進一步擴大樣本量及相關(guān)細胞學研究。