彭永保,劉 淮**,周 群,張俊明

(1.南昌大學附屬婦幼保健院，南昌 330006；2.江西省藥物研究所，南昌 330012)

胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)是指胎兒在母體內因遺傳或環(huán)境因素的影響而未達到其生長潛能[1]。FGR是目前產科最為常見的疾病之一，高居胎兒圍產期死亡病因的第二位[2]。孕期胎盤血流灌注不足是導致FGR發(fā)生的重要原因，但目前機制尚不明確。有學者認為，子宮血流灌注不足引起胎盤缺血缺氧，誘發(fā)滋養(yǎng)細胞凋亡異常增加，進而引起胎盤功能異?？赡苁荈GR發(fā)生、發(fā)展的病理機制之一[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現，FGR及FGR合并子癇前期的發(fā)病率在炎熱季節(jié)明顯高于寒冷季節(jié)和過渡季節(jié)[5]。一些研究也證實，孕期胚胎暴露于高溫環(huán)境可引起胚胎發(fā)育遲緩，甚至胚胎死亡率明顯增加[6-7]。熱暴露是否通過影響子宮、胎盤血流灌注而影響胚胎的發(fā)育，目前還缺乏有力的證據。本研究擬通過構建孕中期熱暴露后子宮缺血模型，觀察熱暴露后子宮缺血對子代宮內發(fā)育的影響及胎盤HSP70、Bax、Bcl-2等蛋白表達的變化，探索高溫應激增加FGR發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 12周齡SPF級SD大鼠54只，其中雌性36只，雄性18只，體重200～250g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物合格證編號：SCXK(湘)2011-0003。置于室內溫度(23±1)℃、相對濕度55%～70%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7d。人工氣候培養(yǎng)箱購于上?；厶﹥x器制造有限公司；兔抗大鼠HSP70、Bax、Bcl-2抗體,鼠抗大鼠HSP70、Bax、Bcl-2抗體,兔抗大鼠β-actin抗體均購于美國Proteintech公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物模型制備與分組 將54只大鼠隨機分為3組，每組18只(雌性12只、雄性6只),雌、雄2∶1合籠過夜,次日上午做陰道涂片，按SD大鼠孕期為3周推算，發(fā)現陰栓當日為妊娠第1天，觀察期設定為妊娠第21天。熱暴露組(Ⅰ組)：妊娠第1～7天環(huán)境溫度控制在(23±1)℃，第8天上午轉移至溫度(35±1)℃人工氣候箱，第14天上午移回至(23±1)℃環(huán)境中飼養(yǎng)；子宮缺血組(Ⅱ組)：孕期全程環(huán)境溫度控制在(23±1)℃，妊娠第14天行雙側子宮動靜脈部分結扎；熱暴露后子宮缺血組(Ⅲ組)：妊娠第1～7天環(huán)境溫度控制在(23±1)℃，第8天上午移置溫度(35±1)℃人工氣候箱，第14天行雙側子宮動靜脈部分結扎，移回至(23±1)℃環(huán)境中飼養(yǎng)。3組大鼠飼養(yǎng)過程中均保持相對濕度在55%～70%，自由飲食。

子宮缺血模型的建立：妊娠第14天以0.3%戊巴比妥(1mL/100g體重)行腹腔麻醉，開腹后暴露雙側子宮動靜脈，選擇子宮血管中段以1-0號微喬縫合線作襯墊，以4-0號絲線結扎子宮雙側動靜脈血管，抽出微喬線，還納子宮、關腹。

1.2.2 觀察指標 在妊娠第1、8、14、21天測量并記錄孕鼠的體質量。妊娠第21天，兩組孕鼠用0.3%戊巴比妥(1mL/100g體重)行腹腔麻醉后行剖腹取胎，暴露腹主動脈，從中采血3mL。檢測存活胎鼠的數量、體重、性別、身長、尾長、外觀有無畸形、胎盤重量及死胎數、胎死率。計算孕鼠孕期體重增加值(妊娠第21天體重-妊娠第1天體重)。胎盤組織稱重，迅速放置液氮凍存。血液標本采集，置抗凝管，3000r/min，離心10min，吸取上層血清，-80℃冰箱保存。

1.2.3 Western blot法檢測胎盤組織中HSP70、Bax、Bcl-2等蛋白表達 取胎盤與子宮剝離面滋養(yǎng)細胞相對豐富部位胎盤組織,經蛋白提取、濃度測定、蛋白變性、電泳分離及轉膜后進行免疫印跡，經封閉、加抗體、洗膜，用增強化學發(fā)光劑(ECL)進行發(fā)光后再行曝光顯影，將顯影條帶放Alpha ImagerTM2200圖像分析處理系統(tǒng)，利用AlphaEase4.0軟件，電腦直接掃描測定顯影條帶積分光密度值(350nm)，條帶的積分光密度值(IDV)即表示蛋白表達量，并計算每份樣本中目的蛋白的相對表達量(目的蛋白/β-actin)以及Bax與Bc1-2的比值(Bax/Bc1-2)。

1.2.4 ELISA法檢測母鼠血清HSP70水平 在預先包被好抗體的包被微孔中，依次加待測樣本、生物素標記物和酶聯親和素，經溫育后徹底洗滌，加底物顯色，用酶標儀在450nm波長下讀取吸光度(A)值，繪制標準曲線，計算待測樣本的HSP70水平。

2 結 果

2.1 孕鼠的一般情況及體重變化 3組均有11只雌鼠參與雌雄合籠過夜并次日陰道圖片陽性。但子宮缺血組、熱暴露后子宮缺血組分別有1只和2只孕鼠妊娠21天解剖子宮未發(fā)現胚胎。目前尚不能確定是由于受孕未成功還是懷孕后早期流產導致。將這些大鼠退出本實驗。妊娠第1天、第8天,3組的孕鼠體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。妊娠第14天，子宮缺血組的孕鼠體重高于熱暴露組和熱暴露后子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，熱暴露組和熱暴露后子宮缺血組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；妊娠第21天，熱暴露后子宮缺血組的孕鼠體重低于熱暴露組和子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，熱暴露組和子宮缺血組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；熱暴露后子宮缺血組的孕鼠孕期體重增加值低于熱暴露組和子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，熱暴露組、子宮缺血組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 3組孕鼠體重變化情況

2.2 胎鼠發(fā)育指標與胎盤重量 3組孕鼠的窩產仔量無顯著差異。熱暴露后子宮缺血組的胎死率明顯高于熱暴露組和子宮缺血組(均P<0.05)，窩活胎數低于熱暴露組和子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；所有胎鼠均未發(fā)現外觀殘缺或畸形。3組胎鼠體重、身長、尾長比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。熱暴露后子宮缺血組的胎盤重量均低于熱暴露組和子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，后兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2、3)。

2.3 胎盤HSP70、Bax、Bcl-2表達及循環(huán)HSP70水平比較 3組胎盤組織中HSP70表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。3組胎盤組織中Bax/Bcl-2比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。熱暴露后子宮缺血組孕鼠血漿HSP70水平高于熱暴露組和子宮缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，但后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4、圖1)。

表2 3組孕鼠子代一般資料比較

表3 3組胎鼠發(fā)育指標與胎盤重量比較

表4 3組胎盤HSP70、Bax、Bcl-2及循環(huán)HSP70相對表達量

3 討 論

高溫應激與子宮血流灌注不足都是引發(fā)FGR的重要因素[8-9]。本研究結果顯示，熱暴露后子宮缺血組孕鼠體重增加顯著減緩，胎死率明顯增加。表明高溫應激與子宮血流灌注不足這兩個病理應激會產生協同效應，進一步影響子代的宮內發(fā)育，使胎死宮內的發(fā)生率顯著升高。本研究中熱暴露后子宮缺血組胎鼠體重與熱暴露組、子宮缺血組比較，差異無統(tǒng)計學意義。推測這可能與熱暴露后子宮缺血組胎死率增加、窩活胎數明顯少于另外兩組有關。

母體因素、胎兒因素和臍帶胎盤因素是引起FGR的3個主要原因，而胎盤因素被認為是最主要的[10-11]。研究發(fā)現，胎盤重量與胚胎發(fā)育密切相關，胎盤重量對胚胎生長發(fā)育的影響甚至超過胎盤的營養(yǎng)代謝與轉運功能[12]。胎盤發(fā)育輕度異常時，可通過增加營養(yǎng)交換表面積，促進胎盤血管生成及降低胎盤厚度等方法來代償[13]。但當胎盤嚴重發(fā)育不良時，胎盤代償功能已經不能滿足胚胎生長發(fā)育的需要，從而導致FGR的發(fā)生。本研究中熱暴露組與子宮缺血組的胎盤重量無顯著差異，兩組孕鼠體重增加值、胎鼠體重、身長、尾長、胎死率、窩產仔量等指標也無顯著差異；熱暴露子宮缺血組的胎盤重量低于熱暴露組和子宮缺血組，胎死率顯著高于熱暴露組和子宮缺血組、窩活胎數顯著低于熱暴露組和子宮缺血組。這進一步證明孕中期熱暴露和子宮缺血都會影響胚胎的宮內發(fā)育，且它們疊加出現時造成的不利影響也具有協同效應。

研究發(fā)現，胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡增加是FGR發(fā)病的重要因素[14-15]。Bax/Bcl-2是反應組織細胞凋亡的敏感指標，且比值與凋亡活躍程度成正比[16-17]。本研究中熱暴露子宮缺血組胎盤組織Bax/Bcl-2比值顯著高于熱暴露組和子宮缺血組，且差異有統(tǒng)計學意義。這表明與單純孕中期熱暴露或單純子宮缺血相比，孕中期熱暴露后子宮缺血會進一步加劇胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡與壞死。這可能是造成熱暴露后子宮缺血組胎盤重量低于其余兩組的原因之一。陳慧萍等[18]通過比較FGR胎兒和正常胎兒胎盤組織細胞的凋亡，發(fā)現FGR患者胎盤合體滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞凋亡明顯增多，提示胎盤組織細胞凋亡活躍可能是引起FGR發(fā)生、發(fā)展的重要病理過程。

HSP70是一種非特異性保護蛋白，可在機體遭遇不良應激時被刺激[19]。Mishra等[20]研究證實，高溫環(huán)境可誘導細胞內熱休克蛋白的表達，并起到減輕高溫引起的細胞損傷作用。前期研究發(fā)現，孕中期熱暴露孕鼠胎盤組織中HSP70表達明顯高于正常對照組[7]。本研究中3組胎盤組織的HSP70表達無顯著差異，而熱暴露后子宮缺血組的母體循環(huán)HSP70水平顯著高于熱暴露組和子宮缺血組，且差異有統(tǒng)計學意義。循環(huán)中HSP70的來源目前還存有爭議，應激狀態(tài)下細胞的主動分泌與細胞壞死后胞內HSP70的釋放入血被認為是主要的途徑[21]。研究發(fā)現，循環(huán)中HSP70水平升高會給機體帶來負面的影響[22-23]，甚至可誘發(fā)細胞死亡[24]。本研究顯示，與熱暴露組和子宮缺血組比較，熱暴露子宮缺血組的循環(huán)HSP70水平高、胎盤重量降低、胎死率升高、胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡增加，胎盤組織HSP70表達無顯著差異。推測循環(huán)中HSP70升高并非單純是細胞壞死增多而釋放入血的結果，其更可能在FGR的發(fā)生、發(fā)展中扮演了一定的作用。

綜上所述，子宮血流灌注不足和孕中期熱暴露都會對胚胎的宮內發(fā)育產生不利影響，且這些不利影響都可通過誘發(fā)胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡、增加母體循環(huán)HSP70表達等影響胚胎的宮內發(fā)育。當這些不利因素相互疊加時，胚胎發(fā)育所受到的不利影響也將進一步加大。有學者認為，胎盤滋養(yǎng)細胞分化發(fā)育不良，終末絨毛的數量、體積及表面積減少，對子宮螺旋動脈的侵蝕不足，導致胎盤血管重鑄不良，胎盤交換面積及絨毛間隙減少，造成胎盤血液灌注不足，進而出現發(fā)育不良,是FGR發(fā)生、發(fā)展的重要機制[25-26]。但本研究只對胎盤的發(fā)育狀況及細胞凋亡進行了分析，沒有對胎盤的病理結構、血管生成與分布及交換面積等相關因素做深入的研究與分析。