楊 璐，劉 洋，王云霞，李 哲，熊亦雯，胡繼君，管一春，孫麗君

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，鄭州 450000)

過去十年，輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)中冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer，F(xiàn)ET)的使用不斷上升。有報告顯示，2006至2012年，F(xiàn)ET周期數(shù)量增加了82.5%，超過了新鮮胚胎移植(fresh embryo transfer，ET)周期的增長速度[1]。大量研究表明，與傳統(tǒng)的ET相比，F(xiàn)ET可能會產(chǎn)生更好的新生兒結局，嬰兒低出生體重(low birth weight，LBW)發(fā)生率和早產(chǎn)(preterm birth，PTB)的風險更低[2-3]。有研究認為，這是由于FET周期具有更自然的子宮環(huán)境，有助于早期胎盤的正常植入，而ET周期中的卵巢刺激引起的高雌激素環(huán)境可能改變子宮內(nèi)膜血管生成和隨后的胎盤植入[4-5]。胎盤介于胎兒與母體之間，是維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要器官。在胎盤的發(fā)育過程中，子宮內(nèi)膜的蛻膜化、滋養(yǎng)層細胞黏附與侵襲、胎盤印跡基因的表達和胎盤血管的形成都受到表觀遺傳修飾的調(diào)控[6]。有關動物研究表明，胎盤組織比胚胎組織更易受到印跡基因表觀遺傳的干擾，這可能導致胎盤發(fā)育和功能的異常以及胎兒發(fā)育的異常[7]。PEGl0是哺乳動物進化中起源較早的印跡基因之一，是反轉錄轉座子來源的父源性表達印跡基因[8]。PEGl0位于7q21染色體，在胎盤、腦、腎、肝、卵巢、睪丸等組織中均有表達，與胎兒生長發(fā)育及胎盤形成植入密切相關[9]。L3MBTLl是位于20q13.12上的父系表達基因，在胎盤、造血干細胞及腦組織中均有表達，可調(diào)節(jié)正常和惡性細胞的自我更新[10]。許多實驗表明，L3MBTLl正常表達對細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂有重要作用[11]。目前關于新鮮胚胎移植與冷凍胚胎移植對胎盤中印跡基因表達及新生兒出生體重的影響尚無定論。為了探討其確切機制，本研究收集了IVF-ET患者新鮮胚胎移植與冷凍胚胎移植分娩的胎盤，檢測印跡基因PEG10和L3MBTLI在兩種胎盤中的表達，為改善IVF/ICSI不良妊娠結局奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年6月至2021年3月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院行IVF/ICSI患者分娩的胎盤。納入標準：產(chǎn)婦年齡21～38歲；無妊娠期合并癥及并發(fā)癥；均為單胎、足月分娩，胎兒無畸形。根據(jù)患者移植周期分為新鮮胚胎移植組(ET組，n=16)與冷凍胚胎移植組(FET組，n=16)。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測胎盤中印記基因PEG10和L3MBTLI表達。本研究經(jīng)鄭州大學第三附屬醫(yī)院道德倫理委員會批準，孕婦知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤組織標本處理 所有標本均在胎盤娩出15min內(nèi)采集，取胎盤中央部位組織，避開出血、壞死及鈣化區(qū)域，洗凈血跡后置于適量RNA保存液，-80℃冰箱儲存。其余樣品用4%多聚甲醛溶液(PFA)固定。

1.2.2 qRT-PCR 根據(jù)生產(chǎn)商使用說明，使用Trizol(Takara,China)試劑提取胎盤組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。使用SYBR Green (Takara,China)在Step One plus thermo cycler(Applied Biosystems)進行real-time PCR，檢測PEG10、L3MBTL1表達水平。使用GAPDH作為內(nèi)參基因對結果進行歸一化處理，采用2-△△Ct法對目的基因相對表達量進行分析。引物序列：PEG10-F 5'-ACCTCTTGGACTTCTGAAT-3'；PEG10-R 5'-TCTTGGAACTGTCTGTATCT-3'；L3MBTL1-F 5'-GTTGACTAGCATTGTGTTCTG-3'；L3MBTL1-R 5'-ATCACCTCCTTGGACCTT-3'；GAPDH-qF 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；GAPDH-qR 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.2.3 Western blot 蛋白裂解液(Thermo Fisher,Carlsbad,CA,USA)處理胎盤組織，提取總蛋白。采用BCA Protein Assay Kit (Solarbio,Beijing,China)檢測各蛋白濃度，制備蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳反應結束后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，依次加一抗、二抗孵育，避光條件下進行顯色反應，洗滌晾干后進行掃描分析。

1.2.4 IHC 對固定在PFA中的胎盤樣品進行常規(guī)脫水、包埋石蠟。石蠟切片脫蠟入水，3% H2O2溶液室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加一抗和二抗工作液，用二氨基苯并(DAB)和底物緩沖液處理3～5min。將切片用蘇木精復染(Sigma，美國)，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料比較 FET組與ET組孕婦年齡、孕周、孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、孕期增重、胎盤重量及新生兒體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，F(xiàn)ET組新生兒出生體重較ET組有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 ET組與FET組一般資料的比較

2.2 兩組患者胎盤組織中PEG10和L3MBTL1表達 ET組的PEG10 mRNA和蛋白表達顯著低于FET組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩組的L3MBTL1 mRNA和蛋白表達水平無顯著差異。見圖1、表2。

2.3 免疫組化法結果 IHC檢測結果顯示，PEG10、L3MBTL1均在胎盤間質(zhì)細胞胞質(zhì)中呈棕褐色表達，細胞核不著色。FET組胎盤組織中PEG10蛋白的信號強度高于ET組，兩組的L3MBTL1蛋白信號強度無明顯差異(圖2)，與Western blot檢測結果一致。

表2 兩組胎盤組織中PEG10和L3MBTL1 mRNA

3 討 論

ART包括人工授精和體外受精-胚胎移植技術，近年來胚胎冷凍已成為ART中的常規(guī)程序，在ART中扮演著重要角色[12]。隨著胚胎冷凍保存技術的發(fā)展，冷凍胚胎的質(zhì)量和植入潛力與新鮮胚胎相似[13]。幾項大型隊列研究表明，與新鮮的IVF-ET相比，F(xiàn)ET周期出生的單胎中，新生兒出生體重增加，PTB和LBW發(fā)生率較低[14-15]。Pelkonen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ET周期出生的新生兒低出生體重(LBW)、小于胎齡兒(small for gestational age，SGA)的風險均低于ET周期。研究發(fā)現(xiàn)，控制性卵巢刺激產(chǎn)生的高雌激素和孕酮濃度可能影響著床相關基因，損害早期胚胎植入和后期胎兒的生長[17]。此外，高雌激素水平還會干擾子宮內(nèi)膜血管生成，這可能影響胎盤的功能。FET移植時患者體內(nèi)雌孕激素水平更接近生理狀態(tài)，對子宮內(nèi)膜容受性和早期著床有積極的影響，更有利于胎盤的植入和發(fā)育。

胎盤的功能可能受多種因素的調(diào)節(jié)，大量研究證實，表觀遺傳機制在胎盤的發(fā)育過程中起著重要作用，對早期胚胎分化和發(fā)育、胎兒生長、胎盤分化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關重要，基因印記紊亂可能導致子代發(fā)育異常、妊娠并發(fā)癥風險增加[18]。本研究中，PEG10和L3MBTL1都是父源性表達的印記基因。Moore等[19]在2015年的研究中表明父系表達的基因促進胎兒生長，而母系表達的基因抑制胎兒生長。PEG10可改善妊娠期新陳代謝，促進孕激素的合成，有利于胎盤植入和胚胎發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，胎盤中PEGl0 mRNA及蛋白表達在FET組明顯高于ET組；FET組新生兒出生體重也較ET組有增加趨勢。梁小妍等關于胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)和印記基因PEG10的研究中發(fā)現(xiàn)，PEG10過度甲基化后，轉錄活性減弱,PEG10蛋白表達降低,抑制了滋養(yǎng)細胞的增殖分化和浸潤,從而導致FGR的發(fā)生[20]。研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜中PEG10表達顯著下調(diào)[21]。Smallwood等[22]在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)了敲除PEG10基因的小鼠，會引起胚胎發(fā)育異常，甚至導致胚胎早期死亡、流產(chǎn)。Lim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，越低出生體重兒臍血中PEG10表達越低。這些研究都表明PEG10在胎兒和胎盤發(fā)育過程中起到重要作用[24]。本研究結果與這些早期研究成果一致。

L3MBTL1在生殖細胞和生殖干細胞早期階段均有表達，并參與人類胚胎干細胞增殖，影響胚胎干細胞向滋養(yǎng)外胚層分化，L3MBTL1基因缺陷可抑制生殖干細胞染色質(zhì)轉錄[25]。L3MBTL1下調(diào)可能增加ART患者流產(chǎn)和胚胎停育的風險，增加子代患印記基因疾病的風險。此前研究報道，ART子代與正常自然受孕子代L3MBTL1基因的表達存在差異[26]。但本研究FET組與ET組胎盤中L3MBTL1表達無顯著差異,提示不同移植周期對L3MBTL1的表達無明顯影響，也可能是由于本實驗樣本量限制造成。盡管人們對人類印跡基因的興趣日益增長，并且認識到表觀遺傳學在人類發(fā)育中的重要性，但是關于印跡基因在人類胎盤發(fā)育和胚胎發(fā)生中的作用的認識仍有限，對于不同移植周期是否影響印跡基因的表達還需進行深入的研究。