方雪婷 張麗 蔡素琴 王聲耀 吳春林

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤死因中位居第4位，復發(fā)和轉移是導致患者死亡的主要原因。大多數(shù)患者在疾病晚期被診斷出來，5年生存率4.7%～32.8%[1]。此外，肝外轉移很常見，最常見的肝外轉移部位是肺，其次是骨、淋巴結和腎上腺。文獻報道，肝細胞癌骨轉移（hepatocellular carcinoma bone metastasis，HCC-BM）的發(fā)生率為3%～20%[2]。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APEX1）具有DNA損傷修復功能以及氧化還原功能，可以調節(jié)多種轉錄因子，與細胞的增殖活化及部分腫瘤的轉移進展有關[3]。本研究小組前期實驗發(fā)現(xiàn)APEX1和Notch受體配體之一JAG1基因在肝細胞癌中的過表達具有相關性[4]?，F(xiàn)有的關于HCC-BM的報道較少，APEX1和JAG1基因是否促進HCC-BM尚不清楚。本研究收集福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院及第二醫(yī)院近年收治的HCC-BM病例，并采用免疫組化同時分析APEX1和JAG1在HCC及HCC-BM中的表達，通過對其臨床及病理特征的分析，探索肝細胞癌惡性進展新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 病例篩選

收集2012年1月—2019年12月就診于福建醫(yī)科大學附屬第一和第二醫(yī)院的肝細胞癌和肝外轉移患者進行資料分析。納入標準：（1）手術后病理檢查確診為肝細胞癌；（2）病理檢查確診為骨轉移。排除標準：（1）混合性肝細胞癌-膽管細胞癌患者；（2）原發(fā)灶為肝細胞癌，但骨轉移為其他來源的惡性腫瘤轉移（如肺癌骨轉移、原發(fā)骨腫瘤等）；（3）原發(fā)灶為肝細胞癌，可疑存在骨病變，但活體組織檢查或切除標本未發(fā)現(xiàn)惡性成分（包括無法取得可以證實存在肝細胞癌骨轉移標本的患者）。本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2 臨床資料

一般資料包括患者性別、年齡等一般情況，骨轉移部位等。病理資料包括：肝腫瘤病理學類型、骨轉移灶病理學特征。

1.3 免疫組化染色

所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，進行HE及免疫組織化學Envision法染色，具體步驟根據(jù)說明書進行。APEX1、JAG1抗體購自英國abcam公司。JAG1陽性定位于細胞質，APEX1陽性定位于細胞質和/或胞核內，本研究將胞質的表達和胞核的表達分開評分。細胞著色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分[5]。根據(jù)陽性細胞所占的百分比分為：無著色細胞為0分，陽性細胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分?？側旧u分=染色強度評分×陽性細胞百分比分數(shù)。＜4分定義為低表達，≥4分為高表達[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，免疫組化結果等計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析及骨轉移的部位及特點

2012年1月—2019年12月在福建醫(yī)科大學附屬第一和第二醫(yī)院接受治療的肝細胞癌和肝外轉移患者共464例，79例發(fā)生骨轉移；其中男性71例，女性8例，患者男女比例8.9∶1；年齡30～86歲，平均年齡（55.20±16.23）歲，中位年齡53歲。本研究共納入HCC-BM患者79例，其發(fā)生率為17.02%（79/464）。單發(fā)骨轉移灶者73例（92.40%），多發(fā)骨轉移灶者6例（7.59%）；其中5例發(fā)生2處骨轉移，1例發(fā)生3處骨轉移。單處骨轉移的發(fā)生率明顯高于多處骨轉移。最常見的骨轉移部位為脊柱59例（72.0%，含頸椎、胸椎、腰椎），其次為下肢骨轉移者9例（11.0%），上肢骨轉移者7例（8.5%）；少數(shù)患者亦可發(fā)生頜骨、胸骨、肩胛骨等部位，見表1。

表1 患者HCC-BM的分布

2.2 APEX1、JAG1蛋白在HCC及HCC-BM中的表達

APEX1蛋白在HCC中細胞核陽性率為55.7%（44/79），在HCC-BM中細胞核陽性率為65.8%（52/79）；兩者相比，APEX1蛋白在細胞核上的表達差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.699，P=0.192）。APEX1蛋白在HCC中細胞質陽性率為46.8%（37/79），在HCC-BM中，細胞質陽性率為63.3%（50/79）；兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.323，P=0.038）。JAG1在HCC-BM中的陽性率為62.0%（49/79），在HCC中的陽性率為41.8%（33/79），兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.490，P=0.011）。因此，在HCC-BM中APEX1蛋白、JAG1蛋白的表達均高于HCC。

2.3 APEX1、JAG1蛋白表達與HCC-BM臨床病理特征的關系

APEX1、JAG1蛋白與臨床病理參數(shù)關系的結果顯示，JAG1蛋白在HCC-BM中表達水平與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、原發(fā)灶數(shù)目等參數(shù)無關（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、是否合并骨外轉移有關（P＜0.05）；APEX1胞質的表達與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、骨轉移數(shù)目、是否合并骨外轉移無關（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、原發(fā)灶的數(shù)目有關（P＜0.05），見表2。

表2 APEX1 和JAG1的表達與肝細胞癌骨轉移臨床病理特征的相關性

2.4 HCC-BM中APEX1、JAG1蛋白表達的相關性分析

在HCC-BM中，APEX1細胞核的陽性率65.8%，細胞質陽性率63.3%，JAG1陽性率62.0%；Spearman秩相關分析顯示APEX1細胞質表達高低與JAG1表達高低呈正相關（r=0.237，P=0.035）。

3 討論

HCC是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，隨著臨床診療水平的不斷進步，HCC患者的總生存時間獲得延長，但是HCCBM發(fā)生率則顯著升高，HCC骨轉移的篩查與診治已成為全球性熱點與難點問題。目前認為血管形成和上皮-間質轉化是HCC骨轉移的主要致病機制，因此明確HCC骨轉移的致病機制有助于臨床腫瘤篩查及診療手段的提高[6]。

本研究收集的HCC-BM病例中，性別比例8.9∶1；中位年齡53歲，提示中老年男性患者發(fā)生骨轉移的概率更大。由于HCC-BM少見，結合文獻結果報道，HCC-BM的發(fā)生率為13%～38.5%[7-8]。本研究共納入HCC-BM患者79例，其發(fā)生率為17.06%，與部分報道結果相近[8]。本研究顯示最常見的骨轉移部位為脊柱（72.0%，含頸椎、胸椎、腰椎），其次為下肢骨轉移者9例（11.0%），上肢骨轉移者7例（8.5%）；少數(shù)患者亦可發(fā)生頜骨、胸骨、肩胛骨等部位，與既往報道一致[9]。

索拉非尼是治療晚期HCC患者的主要化療藥物，但其療效受到耐藥的影響。有研究顯示APEX1的高表達與HCC患者對索拉非尼治療的耐藥性相關。APEX1在索拉非尼耐藥的HCC患者中的表達明顯高于索拉非尼敏感的HCC患者[10]。APEX1參與DNA損傷反應，并在多種人體組織中表達。APEX1的異常表達會破壞多種生理過程，包括細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、平滑肌細胞遷移、細胞周期、細胞凋亡和mRNA穩(wěn)定性[11]。同時，APEX1的表達與骨肉瘤患者的預后呈正相關，且APEX1與骨肉瘤發(fā)生順鉑耐藥密切相關。研究表明線粒體APEX1的高表達可以通過降低Rac1（p-Rac1）的磷酸化來降低ROS的產生，從而進一步促進骨肉瘤對順鉑的耐藥[12]。血清APEX1水平作為膽管癌診斷和預后的潛在生物標志物，在膽管癌患者中，有轉移的患者血清APEX1水平明顯高于無轉移的患者。血清APEX1水平越高，患者生存時間越短。血清APEX1水平可能是診斷和預后的生物標志物；并且APEX1的高表達與膽管癌的化療耐藥相關[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明APEX1是HCC的潛在生物標志物，同時是腫瘤對化療敏感的潛在治療靶點。本實驗應用免疫組化方法檢測APEX1蛋白在79例HCC和HCC-BM中的表達情況，結果顯示在HCCBM中APEX1蛋白在細胞質中的表達高于肝細胞癌組織。分析APEX1的表達與臨床病理特征的關系發(fā)現(xiàn)，在HCC-BM中APEX1胞質的表達與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、骨轉移數(shù)目、是否合并骨外轉移無關（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、原發(fā)灶的數(shù)目有關（P＜0.05）。結合本課題組前期工作[4]，發(fā)現(xiàn)APEX1胞質表達在肝細胞癌中較癌旁肝組織增加，而且在HCC-BM中的表達較肝細胞癌中增加，且APEX1的表達與腫瘤的分化程度、原發(fā)灶數(shù)目密切相關，說明APEX1的表達參與肝細胞癌轉移侵襲過程。

JAG1是5個細胞表面配體之一，主要在高度保守的Notch信號傳導途徑中發(fā)揮作用。JAG1在癌癥生物學的多個方面發(fā)揮作用，包括腫瘤血管生成、腫瘤細胞生長、癌癥干細胞、上皮-間質轉化和轉移過程[14]。在乳腺癌中，JAG1-Notch1-Zeb1-VEGFA介導的血管內分泌信號哺育乳腺癌干細胞[15]。在結腸癌中，JAG1介導APEX1促進腫瘤發(fā)生功能[3]。本組前期關于JAG1與HCC的研究中發(fā)現(xiàn)，JAG1在肝細胞癌中的表達增高，并且其表達與腫瘤術前AFP水平、分化程度、轉移、復發(fā)密切相關，JAG1可能為HCC潛在的獨立預后因子之一。本組結果表明JAG1在HCC-BM中的表達高于HCC，JAG1蛋白在HCC-BM中表達水平與患者性別、年齡、乙肝表面抗原、原發(fā)灶數(shù)目等參數(shù)無關（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、是否合并骨外轉移有關（P＜0.05）。

在結腸癌中，APEX1異常表達并激活Notch信號通路[3]。在乳腺癌中，JAG1促使Notch1依賴性的Zeb1的上調，從而增加了血管內皮生長因子（VEGFA）的產生，并以旁分泌的方式相互誘導內皮細胞JAG1，強調針對血管內分泌的JAG1-Notch1-Zeb1-VEGFA信號通路可以降低乳腺癌的侵襲性[15]。Sun等[16]提出，DNA修復基因APEX1能夠促進一系列細胞因子、生長因子和蛋白酶的產生，其中包括VEGF，從而促進血管生成。APEX1在骨肉瘤中的高表達與通過缺氧誘導因子-1α的激活而上調的VEGF有關，降低APEX1的表達會導致VEGF表達的明顯下降[12]。在膀胱癌中，APEX1的表達也與VEGFA的表達和CD163+腫瘤相關巨噬細胞浸潤增加呈正相關[17]。APEX1在索拉非尼耐藥的HCC患者中的表達明顯高于索拉非尼敏感的HCC患者[10]。因此筆者猜想APEX1可能通過JAG1-Notch1-VEGFA信號通路調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本組通過分析對比APEX1和JAG1在HCC-BM中的表達，發(fā)現(xiàn)HCC-BM中APEX1、JAG1的表達顯著增強，進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)APEX1與JAG1蛋白的表達之間呈正相關。在本課題組前期及本次結果顯示在組織學上APEX1和JAG1之間存在正相關，提示兩者在HCC的侵襲轉移中可能發(fā)揮作用，其具體機制尚需細胞學水平進一步驗證及補充，為HCC-BM的診治提供更多的理論基礎。