姬國杰，豐慧根

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453000)

宮頸癌在女性癌癥中排第2位，是20～39歲女性癌癥死亡的第二大原因[1]。隨著醫(yī)學(xué)治療手段的不斷進展，大部分早期宮頸癌可通過手術(shù)治療獲得治愈[2]，而對于就診時已處于進展期或發(fā)生耐藥的宮頸癌患者，總體預(yù)后仍不樂觀[3]。目前，臨床應(yīng)用的化學(xué)治療方案存在不良反應(yīng)大、藥物利用度低、治療效果不理想等局限。隨著分子靶向治療研究的不斷深入，生物治療這一全新的腫瘤治療模式越來越受到人們的關(guān)注，如中西藥聯(lián)合應(yīng)用能夠降低現(xiàn)階段治療宮頸癌的不良反應(yīng)、增高藥物的利用度或有治療協(xié)同作用，將會改善宮頸癌患者的預(yù)后。索拉非尼是一種新型的多靶點生物靶向治療藥物[4]，研究表明，索拉非尼能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖且呈濃度依賴性[5]。大豆異黃酮是一種天然的雌激素，是大豆生長過程中的次級代謝產(chǎn)物，具有抗癌治癌、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗真菌、抗氧化和改善婦女更年期綜合征等多種生理功能，是一類具有開發(fā)利用價值的天然活性物質(zhì)[6-10]。本課題組前期研究表明，大豆苷元能下調(diào)宮頸癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C) mRNA的表達(dá)，且此效果呈劑量依賴性[11]?；诖?，本研究采用大豆異黃酮與不同濃度索拉非尼聯(lián)合干預(yù)宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察索拉非尼聯(lián)合大豆異黃酮干預(yù)對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖、遷移以及VEGF-C表達(dá)的影響，以期為宮頸癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器宮頸癌Hela細(xì)胞株由本實驗室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度5 g·L-1噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、體積分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺均購自北京索萊寶公司，大豆異黃酮、索拉非尼均購自美國Sigma公司；SYBR PreMix購自大連TaKaRa公司，蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測試劑盒、IP細(xì)胞裂解液及Western一抗、二抗去除液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司，兔抗人VEGF-C單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購自英國Abcam 公司；凝膠成像儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、落地冷凍高速離心機、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自美國Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympms公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將Hela細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1，置于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%～90%時取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)期的Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為3×107L-1，按每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板上，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿每孔底部后棄上清，然后隨機分為對照組、大豆異黃酮組、1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組；對照組用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組分別滴加100 μL終濃度為1、2、4、6 mmol·L-1的索拉非尼培養(yǎng)，1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組分別滴加100 μL終濃度為1、2、4、6 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，并設(shè)置空白對照組(僅加入完全培養(yǎng)基)，設(shè)4個復(fù)孔；然后，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜，在搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于波長490 nm處測量各孔的吸光值，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=[1-(加藥組細(xì)胞吸光度-空白孔吸光度)/(對照組細(xì)胞吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，調(diào)整密度約為3×107L-1，按每孔1 000 μL接種于6孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿每孔底部后棄上清，用10 μL的槍頭劃線，用生理鹽水清洗1～2次，立即拍照；然后，隨機分為對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，對照組用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，2 mmol·L-1索拉非尼組和4 mmol·L-1索拉非尼組分別滴加100 μL終濃度為2、4 mmol·L-1的索拉非尼培養(yǎng)，2 mmol·L-1索拉非尼+索拉非尼組和4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組分別滴加100 μL終濃度為2、4 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，再次拍照記錄；使用Imang J軟件對細(xì)胞劃痕面積進行分析，計算細(xì)胞遷移抑制率，細(xì)胞遷移抑制率=[1-(0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%，用細(xì)胞遷移抑制率表示細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞遷移抑制率越高表示遷移能力越弱。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測Hela細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá)取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，調(diào)整密度約為3×107L-1，按每孔1 000 μL接種于六孔板，隨機分為對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，對照組用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，4 mmol·L-1索拉非尼組滴加100 μL終濃度為4 mmol·L-1的索拉非尼培養(yǎng)，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為4 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；4 ℃條件下，用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測VEGF-C mRNA。引物序列：β-actin上游引物序列為5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物序列為5′-AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA-3′，產(chǎn)物長度140 bp；VEGF-C上游引物序列為5′-CAGTTACGGTCTGTGTCCAGT-3′，下游引物序列為5′-GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG-3′，產(chǎn)物長度為300 bp。反應(yīng)體系：SYBR PreMix 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，cDNA 2.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算VEGF-C mRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 Western blot法檢測Hela細(xì)胞中VEGF-C蛋白的表達(dá)按“1.2.4”項方法進行細(xì)胞分組與培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合時收集細(xì)胞，然后滴加IP細(xì)胞裂解液+蛋白酶抑制劑(體積比991)于冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心5 min，取上清。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品14混合后渦旋震蕩混勻，沸水浴3 min，冷卻至室溫后電泳，取蛋白條帶，半干轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)(100 mA，45 min)，在含吐溫-20的Tris緩沖鹽溶液(Tris buffered saline and Tween-20，TBST)中洗膜3次，每次10 min，麗春紅染色液染膜，置于搖床上5 min，蒸餾水漂洗2～3次，TBST清洗2～3次，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，將PVDF 膜用TBST清洗3遍，浸入稀釋后(稀釋度1800) 的兔抗人VEGF-C單克隆抗體孵育液中，4 ℃孵育過夜；然后再用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋度15 000)孵育1.5 h；ECL發(fā)光液染色2 min，加入適量的Western一抗、二抗去除液，TBST漂洗3次，每次 5 min。以β-actin為內(nèi)參蛋白，用于蛋白測定。應(yīng)用凝膠成像儀進行圖形采集，Imang J 軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 10組細(xì)胞增殖抑制率比較對照組、大豆異黃酮組、1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞增殖抑制率分別為 (0.00±0.00)% 、(1.34±0.16)%、(8.13±1.35)%、(44.09±1.57)%、(65.45±0.24)%、(73.78±2.09)%、(19.68±0.75)%、(57.08±0.57)%、(70.71±0.56)%、(83.31±0.77)%。1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組和大豆異黃酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大豆異黃酮組與對照組細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05 )。1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組細(xì)胞增殖抑制率隨索拉非尼濃度的增加顯著升高(P<0.05)；1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞增殖抑制率隨索拉非尼濃度的增加顯著升高(P<0.05)；1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組細(xì)胞增殖抑制率分別高于對應(yīng)的1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 ) 。

2.2 對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移抑制率比較結(jié)果見圖1。對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移抑制率分別為(0.00±0.00)%、(16.81±0.35)% 、(36.70±0.81)%、(58.80±0.49)%、(44.93±1.01)%、(95.26±2.19)%。2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移抑制率均高于對照組和大豆異黃酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )；對照組與大豆異黃酮組細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；4 mmol·L-1索拉非尼組細(xì)胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼組，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼組，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞遷移率顯著高于4 mmol·L-1索拉非尼組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表1。4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于對照組和大豆異黃酮單藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與大豆異黃酮組細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于4 mmol·L-1索拉非尼組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

據(jù)報道，我國每年約有11萬例新發(fā)病的宮頸癌患者，宮頸癌已成為全球女性致命的婦科惡性腫瘤之一[12-13]。腫瘤的存在、生長及轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成這2個環(huán)節(jié)可以達(dá)到治療腫瘤的目的[14]。目前，宮頸癌的治療方法主要有手術(shù)治療和放化療，晚期復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療多使用化學(xué)治療配合手術(shù)和放射治療；而靶向治療、免疫治療及其聯(lián)合治療可用于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移宮頸癌的全身系統(tǒng)性治療。索拉非尼靶向作用于腫瘤細(xì)胞，可有力抑制原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶，且有較強的激酶選擇特性[5]。在新生血管形成及腫瘤進展中，索拉非尼對多種酪氨酸激酶受體有明顯抑制作用，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2和3、血小板衍生生長因子受體、受體酪氨酸激酶等[15-16]。此外，索拉非尼可抑制細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如G1/S-特異性周期蛋白-D、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 1[17]，使增殖期細(xì)胞不能通過“G1-S”調(diào)節(jié)點，阻滯在G1期從而阻斷細(xì)胞周期進展，進而影響細(xì)胞生長，促進凋亡[18]。研究報道，索拉非尼可以延長腫瘤患者的生存期，但其誘發(fā)的不良反應(yīng)及耐藥限制了索拉非尼在臨床中的使用[19-20]。隨著現(xiàn)代藥理研究的推進和中藥提取技術(shù)的更新以及中藥有效成分對抗腫瘤作用機制研究的進一步加深，中藥因其毒副作用小、廉價等優(yōu)勢在宮頸癌藥物治療方面展現(xiàn)出較大優(yōu)勢，這為臨床宮頸癌抗癌藥物的研制和應(yīng)用開拓了新方向[21]。研究表明，大豆異黃酮對乳腺癌[22]、前列腺癌[23]、皮膚癌[24]等均有較好的預(yù)防和治療作用。因此，推測大豆異黃酮和索拉非尼聯(lián)合治療宮頸癌有較好的效果。

本研究結(jié)果顯示，不同劑量索拉非尼組、不同劑量索拉非尼+大豆異黃酮尼聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對照組和大豆異黃酮組，細(xì)胞遷移抑制率顯著高于對照組和大豆異黃酮組；索拉菲尼組和索拉非尼+大豆異黃酮組隨著索拉菲尼濃度增高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞遷移抑制率顯著升高，遷移能力降低；且與對照劑量的索拉菲尼組相比，大豆異黃酮+索拉非尼聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高，細(xì)胞遷移抑制率顯著升高，遷移能力顯著降低；說明大豆異黃酮可以協(xié)同索拉菲尼抑制Hela細(xì)胞的增殖和遷移，且與索拉菲尼呈劑量依賴性。

VEGF-C是近幾年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，是一種經(jīng)典的 Wnt 信號通路拮抗因子，作為一種抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，索拉非尼組、大豆異黃酮+索拉非尼聯(lián)合組細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組和大豆異黃酮組；且在同一索拉非尼終濃度下，大豆異黃酮+索拉非尼聯(lián)合組細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著低于索拉非尼組；說明索拉菲尼聯(lián)合大豆異黃酮可能是通過降低VEGF-C在Hela細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制Hela細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，大豆異黃酮聯(lián)合索拉菲尼對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力的抑制效果顯著優(yōu)于單獨應(yīng)用索拉菲尼，其機制可能是大豆異黃酮協(xié)同索拉非尼下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表達(dá)。但是，本研究僅在體外細(xì)胞進行，今后需進一步進行小鼠體內(nèi)實驗研究，進而為生物治療宮頸癌提供新思路和理論依據(jù)。