黃玉斌，劉 霄，徐翠香，黃曉燕，王建華(1.西安醫(yī)學(xué)院研究生處，西安 710021；2.陜西省人民醫(yī)院，a.普外二科；b.陜西省感染與免疫疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710068）

近年來惡性腫瘤的發(fā)病率趨于年輕化和逐漸增高趨勢[1]，對于中晚期惡性腫瘤患者的根治方法主要以手術(shù)聯(lián)合放、化療為主，然而并未給中晚期實(shí)體瘤患者帶來長期的生存獲益[2-3]。腫瘤復(fù)發(fā)的原因較多，近年來免疫微環(huán)境改變導(dǎo)致的腫瘤免疫逃逸被認(rèn)為是主要危險(xiǎn)因素之一，成為了目前腫瘤免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)內(nèi)容[4]。腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與機(jī)體自身免疫密切相關(guān)，正常機(jī)體處于免疫動態(tài)平衡狀態(tài)，而惡性腫瘤患者免疫負(fù)向調(diào)節(jié)通路活化，導(dǎo)致免疫失衡、腫瘤微環(huán)境改變[5]。其中程序性死亡分子1（programmed death-1,PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand-1,PD-L1）信號通路是啟動這一系列過程的主要機(jī)制之一[6]。近年來 PD-1抑制劑在中晚期惡性腫瘤的治療中已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，尤其在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌及霍奇金淋巴瘤等的治療中取得了較好的療效[7-8]。大量研究表明，PD-1抑制劑能改變惡性腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞的功能和比例，如 CD3+T,CD4+T,CD8+T,CD4+/CD8+細(xì)胞等，從而改善惡性腫瘤患者預(yù)后[9]。但在臨床研究中，很少涉及在治療過程中對淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化的探究，故本研究旨在通過分析中晚期惡性腫瘤患者應(yīng)用 PD-1抑制劑治療外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的動態(tài)變化，探討 PD-1抑制劑對機(jī)體的免疫功能及近期療效的影響，為臨床惡性腫瘤患者制定個(gè)體化治療方案提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月～2021年1月陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科惡性腫瘤患者144 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理或組織活檢確診為中、晚期腫瘤患者，既往未行免疫抑制藥物治療或診斷病毒性疾??；②行為狀態(tài)良好，卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performancestatus,KPS）評分≥70分，生存時(shí)間＞3 個(gè)月；③具有計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）或核磁共振（MRI）等可評估的腫瘤病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)嚴(yán)重心、肺、肝等器官功能障礙疾病；②伴有免疫系統(tǒng)性疾??；③未完成4 個(gè)周期治療或因疾病進(jìn)展更換治療方案。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共入組中、晚期惡性腫瘤患者144 例，其中男性70 例，女性74 例；年齡28～78 歲，中位年齡59 歲；美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤分期為III期和IV 期（III期：45 例，IV 期：99 例）；腫瘤類型包括肺癌40 例，胃癌25 例，結(jié)直腸癌22 例，乳腺癌16 例，宮頸癌7 例，腎癌6 例，胰腺癌5 例，肝癌、卵巢癌各4例，食管癌、子宮內(nèi)膜癌、小腸癌、前列腺癌各2例，神經(jīng)外胚瘤、膀胱癌、黑色素瘤、胸腺瘤、牙齦癌、鼻咽癌、甲狀腺癌各1 例。隨機(jī)分為三組：①聯(lián)合治療組（PD-1 單抗+化療）患者54 例；②PD-1單抗組患者38 例；③單純化療組患者52 例。三組患者性別、年齡、腫瘤類型及治療前淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上患者均知情同意并經(jīng)陜西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 BD FACSanto 流式細(xì)胞儀及其抗體（抗CD3 FITC,抗 CD4 PE,抗 CD8 PE,抗CD19 PE,CD16 CD56 PE，紅細(xì)胞裂解液），均由美國 Becton Dickinson 公司提供。CT和磁共振成像（MRI）系統(tǒng)由德國Siemens 公司提供。所有操作嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：①聯(lián)合治療方案：紫杉醇 +pembrolizumab 單抗方案（第1 天紫杉醇200mg/m2，第1 天pembrolizumab 單抗2mg/kg）；紫杉醇 +nivolumab 單抗方案（第1 天紫杉醇200mg/m2，第1 天nivolumab 單抗3mg/kg）。 ②PD-1 單抗治療方案：nivolumab 單抗（第1 天3mg/kg）或pembrolizumab 單抗（第1 天2mg/kg）。③化療方案：紫杉醇+卡鉑方案（第1 天紫杉醇260mg/m2，卡鉑200mg/m2）或紫杉醇+順鉑方案（第1 天紫杉醇200mg/m2，第1，2 天順鉑50mg/m2）。三種治療方案均以每3 周為1 個(gè)周期。

1.3.2 檢測及觀察指標(biāo)：治療前及每周期治療結(jié)束后第21 天，空腹抽取肘靜脈血5ml，加入10 ml 抗體，室溫下避光孵育20 min,加入紅細(xì)胞裂解液，避光靜置10 min,1 500 r/min 離心20 min,棄上清，洗滌3 次加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）上機(jī)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群 CD3+T,CD4+T,CD8+T,CD4+/CD8+,B 細(xì)胞(CD19+)及 NK細(xì)胞(CD16+CD56+)數(shù)量水平。觀察指標(biāo)：①比較三種方案治療前后淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化趨勢。②比較三種方案之間淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化差異。③比較三種方案之間療效差異。

1.3.3 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：所有患者治療前及第4 周期治療后3 周行 CT 或 MRI 檢查評價(jià)療效。采用WHO 可測量實(shí)體瘤療效統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[10]：完全緩解（complete response,CR）：臨床檢查腫瘤完全消失；部分緩解（partial response,PR）：腫瘤最大直徑與其最大垂直徑的乘積減少＞50%以上；疾病穩(wěn)定（stable response,SD）：腫瘤最大直徑與其最大垂直徑的乘積減少 ＜ 50% 或增加 ＜ 25%；疾病進(jìn)展（progressive response,PD）：腫瘤最大直徑與其最大垂直徑的乘積增加 ＞ 25%及其他轉(zhuǎn)移征象。有效組包括 CR和 PR；無效組包括 SD和 PD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)多組比較采用單因素及兩因素重復(fù)測量方差分析（統(tǒng)計(jì)量為F）；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量為χ2）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同治療方案淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化趨勢對比見表1。與治療前比較，經(jīng)過連續(xù)4 個(gè)周期治療，54 例聯(lián)合治療組患者外周血CD3+T,CD4+T,CD4+/CD8+及 NK 細(xì)胞數(shù)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.978～448.929，均P＜0.05），CD8+T 細(xì)胞數(shù)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=636.362，P＜0.05），B 細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.941，P＞0.05）；38 例 PD-1 單抗組患者外周血 CD3+T,CD4+T,CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.174～87.558,，均P＜0.05），CD8+T 細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=189.966，P＜0.05），B 細(xì)胞及 NK 細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.328，2.065，均P＞0.05）；52 例化療患者外周血CD3+T,CD4+T,CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.312～130.232,，均P＜0.05），CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞及NK 細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.084～2.592，均P＞0.05）。

表1 三種治療方案淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化對比(±s)

表1 三種治療方案淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化對比(±s)

指標(biāo)組別治療前治療第一周期治療第二周期治療第三周期治療第四周期F 值P 值CD3+聯(lián)合治療55.67±10.6856.07±11.2860.81±10.6364.99±11.3566.42±10.74315.579＜0.001 PD-1 單抗55.12±11.8155.76±11.7559.15±11.3961.64±11.3064.11±12.3165.93＜0.001化療54.90±11.6254.54±11.7654.82±11.7656.05±11.8258.43±11.79130.232＜0.001 CD4+聯(lián)合治療25.25±6.5026.31±6.2129.76±7.0133.26±7.2135.61±7.13109.425＜0.001 PD-1 單抗25.23±7.0325.82±6.5128.74±7.9732.82±6.9234.59±7.4287.558＜0.001化療25.66±6.7326.86±6.6225.80±6.7727.07±6.8228.43±6.7120.893＜0.001 CD8+聯(lián)合治療30.07±7.4429.07±7.1924.55±7.5022.76±7.6719.62±7.50636.362＜0.001 PD-1 單抗30.03±9.5929.44±9.1625.34±10.0722.52±9.5720.33±9.61189.966＜0.001化療30.26±10.8629.67±11.6829.53±11.7129.02±12.1529.70±11.812.5920.058 CD4+/CD8+聯(lián)合治療0.89±0.330.96±0.361.33±0.581.61±0.632.11±1.1044.978＜0.001 PD-1 單抗0.93±0.420.95±0.371.32±0.651.80±1.202.13±1.3315.174＜0.001化療0.98±0.451.03±0.481.05±0.541.12±0.541.13±0.557.312＜0.001 B 細(xì)胞聯(lián)合治療5.87±5.305.76±4.925.63±4.625.79±5.045.87±4.940.9410.448 PD-1 單抗5.73±3.215.90±3.165.93±3.226.10±3.736.02±3.010.3280.859化療5.68±3.685.57±3.535.68±3.465.61±3.415.64±3.770.0840.987 NK 細(xì)胞聯(lián)合治療25.94±9.1226.79±9.4331.29±8.7632.06±8.8533.13±9.07448.929＜0.001 PD-1 單抗25.56±11.0925.74±10.9025.95±11.1026.27±10.7126.57±10.442.0650.107化療25.50±12.1025.74±12.0225.57±11.8026.10±12.0426.03±11.730.7880.534

2.2 不同治療方案及周期淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化 根據(jù)三組治療方案的不同，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)兩因素重復(fù)測量方差分析比較不同組別、不同治療周期淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化，Mauchly 球形檢驗(yàn)結(jié)果均顯示P＜0.05，證明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不對稱，以“多變量檢驗(yàn)結(jié)果”為此次研究最終結(jié)果。結(jié)果顯示：經(jīng)過連續(xù)4 個(gè)周期治療，三種治療方案 CD3+T,CD4+T和CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=423.589,202.709,56.095,均P＜0.05），CD8+T 細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=328.596,P＜0.05)。與化療組比較，聯(lián)合治療組及 PD-1 單抗組 CD4+T,CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加均顯著增加（F=4.192,5.362,均P＜0.05），CD8+T細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.365,P＜0.05)；CD3+T 細(xì)胞數(shù)量在不同治療方案及周期間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.764,P＞0.05)。三種治療方案 B 細(xì)胞數(shù)量在不同治療方案及周期間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.434,P＞0.05)。聯(lián)合治療組 NK 細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.062,P＜0.05）。與化療組比較，聯(lián)合治療組 NK 細(xì)胞數(shù)量隨治療周期數(shù)增加顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.032,P＜0.05），PD-1 單抗組與化療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.009,P＞0.05)。

2.3 不同治療方案多周期治療后療效比較 54 例聯(lián)合治療患者有效組 44 例(CR 14 例，PR 30 例)，無效組 10 例(SD 7 例，PD 3 例)，治療有效率為81.48 % ；38 例 PD-1單抗治療患者有效組32例(CR 4 例，PR 28 例)，無效組6 例(SD 4 例，PD 2 例)，治療有效率為84.21%；52 例化療治療患者有效組33 例(CR 8 例，PR 25 例)，無效組19 例(SD 14例，PD 5 例)，治療有效率為63.46 % ；三種不同治療方案療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.710,P=0.035）。

3 討論

隨著腫瘤疫苗、CAR-T 細(xì)胞療法及免疫檢查點(diǎn)阻斷等治療手段的出現(xiàn)，免疫療法再次成為腫瘤治療研究的前沿和熱點(diǎn)，其中免疫檢查點(diǎn) PD-1/PD-L1 通路引起了國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注。作為目前腫瘤治療領(lǐng)域中最具前景的研究方向之一，PD-1 于 1992年被日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)并命名。研究證實(shí)，PD-1/PD-L1 在正常機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)作用，防止機(jī)體 T 淋巴細(xì)胞過度激活從而導(dǎo)致自身免疫損害；而腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞則可利用此免疫檢查點(diǎn)逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與殺傷[11]。PD-1 在活化的 T,B 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上表達(dá)，其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有兩個(gè)酪氨酸殘基：膜近端的一個(gè)構(gòu)成免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)，另一個(gè)構(gòu)成免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)。當(dāng) PD-1/PD-L1 結(jié)合后，位于 PD-1 ITSM 內(nèi)的酪氨酸殘基被磷酸化，并可招募蛋白酪氨酸磷酸酶，該蛋白酶可誘導(dǎo)多種關(guān)鍵信號激酶去磷酸化，促使腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞耗竭[12]。PD-L1則表達(dá)于包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型，其在正常組織中表達(dá)是生理性免疫耐受檢查點(diǎn)，在機(jī)體受損后控制自身免疫反應(yīng)。然而腫瘤細(xì)胞也可以利用 PD-L1 來減弱 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[13]。惡性腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中高表達(dá) PD-L1，與招募在腫瘤微環(huán)境周圍免疫細(xì)胞表達(dá)的 PD-1 結(jié)合，激活PD-1/PD-L1 通路，使整個(gè)腫瘤微環(huán)境呈免疫抑制狀態(tài)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。近年來，PD-1抑制劑臨床研究取得重大進(jìn)展，為部分中晚期實(shí)體瘤患者的治療帶來了新的希望。

研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與宿主的免疫狀態(tài)相關(guān)，在免疫防御中起決定作用的是細(xì)胞免疫。免疫系統(tǒng)中各群淋巴細(xì)胞相互作用，維持機(jī)體免疫動態(tài)平衡。然而研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比例會出現(xiàn)異常，如抑制性 CD8+T 細(xì)胞比例升高，輔助性 CD4+T 細(xì)胞比例下降，CD4+/CD8+比例降低。而當(dāng)腫瘤負(fù)荷降低或解除時(shí)，淋巴細(xì)胞亞群則逐漸恢復(fù)平衡。目前 PD-1抑制劑在臨床應(yīng)用過程中，部分患者對其響應(yīng)率增高，因此，選擇T,B 淋巴細(xì)胞亞群及 NK 細(xì)胞數(shù)量水平的動態(tài)變化作為監(jiān)測 PD-1抑制劑治療腫瘤患者的療效及預(yù)后指標(biāo)是有參考價(jià)值的。本研究證實(shí)所有納入患者在連續(xù)4 個(gè)周期治療過程中 CD3+T,CD4+T和CD4+/CD8+細(xì)胞比例均顯著增加，其機(jī)制與腫瘤患者細(xì)胞免疫功能紊亂及受抑制有關(guān)[14-15]，經(jīng)過有效地治療后腫瘤負(fù)荷降低，細(xì)胞免疫功能逐漸恢復(fù)。同時(shí)研究顯示，聯(lián)合治療組及 PD-1 單抗治療組從第 2周期開始 CD4+T,CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著升高，CD8+T 細(xì)胞數(shù)量顯著降低，化療組淋巴細(xì)胞數(shù)量則恢復(fù)較慢。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與化療組比較，聯(lián)合治療組與 PD-1 單抗治療組 CD4+T,CD4+/CD8+細(xì)胞比例顯著升高，CD8+T 細(xì)胞比例顯著降低。與此同時(shí)，臨床療效觀察發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組與 PD-1 單抗治療組治療有效率顯著高于化療組；其涉及機(jī)制可能與免疫治療激活了機(jī)體的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，PD-1抑制劑的使用解除了 T 細(xì)胞受抑制狀態(tài)，使其正常活化增殖，細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞比例升高。此外，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)化療引起的骨髓抑制能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，這種反饋穩(wěn)態(tài)性增生能夠增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答[16]，殺傷腫瘤細(xì)胞。研究已證實(shí) PD-1抑制劑可阻斷 PD-1 在 T 細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞相互作用階段的抑制信號傳導(dǎo)，同時(shí)在效應(yīng)階段阻斷 PD-1與腫瘤細(xì)胞上的 PD-L1 結(jié)合，恢復(fù)細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞的功能[17]?；熓侵委熌[瘤的經(jīng)典有效手段之一，研究發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原性，增加免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的敏感性[18]，直接影響細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。因此，由于 PD-1抑制劑和化療藥物作用機(jī)制的不同，二者聯(lián)合治療可發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

本研究著重分析了外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的動態(tài)變化及近期療效，但各種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及腫瘤細(xì)胞之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，因此需要更多的檢測腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化趨勢，才可能對免疫治療療效起到更好的預(yù)測作用。此外，本研究的樣本量較小，觀察治療周期數(shù)短，作為一個(gè)初步探索性的研究，尚需大樣本前瞻性的臨床研究進(jìn)一步探索，為實(shí)現(xiàn)腫瘤患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供參考，在減少不良反應(yīng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)最大化。