王 允，申重陽，韓建軍，賈 利，高 飛，何 君，閔燕梅

(1.綿陽市第三人民醫(yī)院/四川省精神衛(wèi)生中心腫瘤內科，四川綿陽 621000；2.成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，成都 610041)

胃癌為全球發(fā)病率第四的惡性腫瘤，居惡性腫瘤病死原因第二位，胃癌晚期患者5年生存率僅20%～25%，預后差[1-2]。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）被認為是胃癌的最主要危險因素，研究報道，約69%胃癌患者伴Hp 感染，且Hp 感染可能會促進胃癌發(fā)病及進展，但具體機制尚未明確[3]。研究報道，Hp 感染可造成胃黏膜炎癥與癌前病變，導致胃癌發(fā)生、進展[4]。白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）可參與組織破壞及慢性炎癥，屬驅動癌癥炎癥細胞因子[5]。熱休克蛋白-70（heat shock protein-70，HSP-70）可參與自身免疫性損傷及機體炎癥過程，影響癌細胞浸潤、黏附能力，促進惡性腫瘤發(fā)生、進展[6]。miRNA 于腫瘤中可發(fā)揮類似抑癌基因與致癌基因作用。本研究擬通過分析胃癌并發(fā)Hp感染患者血清miR-101，HSP-70和IL-1β表達水平與腫瘤增殖和侵襲力的相關性，初步探究Hp促進胃癌進展的機制，為胃癌診療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年2月～2020年2月綿陽市第三人民醫(yī)院胃癌患者120 例為觀察組（依據(jù)Hp 檢測結果分為胃癌Hp 陽性組68 例、胃癌Hp 陰性組52 例），同期慢性胃炎患者86 例為對照組。納入標準：①胃癌Hp 陽性組、胃癌Hp 陰性組均符合《中國早期胃癌篩查及內鏡診治共識意見》[7]中胃癌有關診斷標準，且經組織病理學檢查證實，既往無免疫治療與放化療史；②對照組均符合《中國慢性胃炎診治共識意見》[8]中慢性胃炎診斷標準，近兩個月未采取系統(tǒng)治療；③各組均未采取抗Hp 治療，知曉本研究，簽訂知情同意書。排除標準：①并發(fā)嚴重肝腎疾??；②急性心肌梗死；③并發(fā)腦梗死、顱腦損傷等嚴重腦血管疾?。虎懿l(fā)精神系統(tǒng)疾??；⑤并發(fā)胃底食管靜脈曲張、腸梗阻、腸穿孔；⑥并發(fā)其他部位惡性腫瘤；⑦近期曾應用激素、非甾體類抗生素治療。其中胃癌Hp 陽性組男性36 例，女性32 例，年齡54～76歲，平均年齡62.72±7.09 歲；體質量指數(shù)（BMI）16～28 kg/m2，平均BMI 22.79±2.07kg/m2；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期26 例，并發(fā)癥：糖尿病16 例，高脂血癥19 例，高血壓24 例。胃癌Hp 陰性組男性30 例，女性22 例，年齡53～79歲，平均年齡63.68±6.14 歲；BMI 17～28 kg/m2，平均BMI 23.05±2.46kg/m2；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期23 例，并發(fā)癥：糖尿病10 例，高脂血癥12 例，高血壓16 例。對照組男性47 例，女性39 例，年齡51～78 歲，平均年齡61.75±7.36 歲；BMI 16～27 kg/m2，平均 BMI 22.42±2.18kg/m2；并發(fā)癥：糖尿病18 例，高脂血癥21 例，高血壓27 例。各組年齡、性別、BMI，并發(fā)癥等一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 Megafuge2.0R 高速離心機購于德國Heraeus 公司；MDF382 型超低溫冰箱購于日本SANYO 公司；MK3 型酶標儀購于芬蘭雷柏公司；7500 型實時熒光定量PCR 儀購于美國ABI 公司；GVE-2100 型電子胃鏡購于上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；HUBT-20P 型Hp 檢測儀購于上海三崴醫(yī)療設備有限公司。酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購于南京建成生物工程研究所。miR-101，腫瘤增殖、侵襲基因檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清指標檢測方法：入院后采集患者清晨空腹靜脈血6 ml，以酶聯(lián)免疫吸附法測定血清HSP-70，IL-1β水平；提取總RNA，鑒定RNA 純度與質量濃度，以實時熒光定量PCR 法測定血清miR-101 相對表達量，結果以2-△△Ct表示，操作嚴格按儀器與試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.2 Hp 感染測定方法：①胃鏡檢查：于胃鏡下取胃黏膜組織，應用甲醛溶液（濃度10%）固定，石蠟包埋，做連續(xù)切片，采取Giemsa 法染色，1 000倍顯微鏡下進行觀察，若切片組織染色為紫紅色則判定為Hp 陽性。②碳14 尿素呼氣試驗：于空腹下進行試驗，口服碳14 尿素膠囊，15 min 后，囑患者向呼氣卡呼氣約3 min，而后將呼氣卡插入至Hp檢測儀，進行自動檢測，記錄Hp 感染U 值，若測定Hp 感染U 值≥100 dpm/mmol 則判定為陽性。結合胃鏡檢查與碳14 尿素呼氣試驗結果，若兩項結果均為陽性則判斷為Hp 感染[9]。

1.3.3 胃癌組織中腫瘤增殖、侵襲基因測定方法：手術切除胃癌患者病灶后，取適量胃癌組織，以液氮凍存30 min 后置于-80 ℃冰箱中儲存；以RNA提取試劑盒將組織中總RNA分離，而后以cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄總RNA 為cDNA；采取cDNA 樣本稀釋（比例為1∶5），以實時熒光定量PCR 法測定胃癌組織中腫瘤增殖基因[磷脂酰肌醇-3 激酶催化亞基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit δ，PIK3CD），C-myc癌基因（C-myc oncogene，C-myc），zeste 基因增強子同源物2（zeste gene enhancer homolog 2，EZH2）]，侵襲基因[泛素樣含PHD和環(huán)指域1（ubiquitin-like containing PHD and ring finger domain 1，UHRF1），Vav3 癌基因（Vav3 oncogene，Vav3）]的mRNA表達量。

1.3.4 隨訪至2021年2月探討血清miR-101，HSP-70，IL-1β 對胃癌并發(fā)Hp感染患者生存率的影響。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）描述，行χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差(±s)描述，多組間比較采取單因素方差分析，進一步兩兩組間比較行SNK-q檢驗，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；Hp 感染與胃癌患者血清各指標的關系采用Pearson 相關分析；胃癌并發(fā)Hp感染患者血清各指標與胃癌組織中腫瘤增殖、侵襲基因關系應用Spearman 相關性分析；繪制Kaplan-Merier 生存曲線，觀察患者生存率。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比較 見表1。胃癌Hp 陽性組血清miR-101水平低于胃癌Hp 陰性組、對照組（t＝11.707，22.969，均P＜0.001），且胃癌Hp 陰性組低于對照組（t＝12.786，P＜0.001），HSP-70，IL-1β水平及Hp 感染U 值高于胃癌Hp 陰性組、對照組（t＝7.877，18.176；6.445，11.817；40.674，58.298，均P＜0.001），且胃癌Hp 陰性組高于對照組（t＝8.158，4.863，9.984，均P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比較(±s)

表1 各組血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平，Hp 感染U 值比較(±s)

項目胃癌Hp 陽性組（n ＝68）胃癌Hp 陰性組（n ＝52）對照組（n ＝86）FP miR-1010.51±0.130.82±0.161.38±0.29317.051＜0.001 HSP-70（pg/L）2.73±0.691.80±0.571.14±0.38160.533＜0.001 IL-1β（ng/L）42.07±18.5423.61±10.3816.37±7.0979.650＜0.001 Hp 感染U 值（dpm/mmol）246.59±31.2859.26±12.6841.35±8.392 297.784＜0.001

2.2 Hp 感染與胃癌患者血清各指標水平關聯(lián)性分析 Pearson 相關性分析顯示，Hp 感染U 值與胃癌Hp 陽性組患者血清miR-101水平呈顯著負相關(r=-0.629,P＜0.05)，與HSP-70，IL-1β水平呈顯著正相關（r=0.574,0.539,均P＜0.05）；Hp 感染U值與胃癌Hp 陰性組患者血清miR-101，HSP-70，IL-1β水平無明顯相關性（r=-0.237,0.198,0.174,均P＞0.05）。

2.3 胃癌Hp 陽性組不同血清指標水平患者組織中腫瘤增殖、侵襲基因表達比較 見表2。以胃癌Hp 陽性患者血清miR-101，HSP-70，IL-1β 水平平均數(shù)為界限，分為miR-101，HSP-70，IL-1β高水平、低水平患者。miR-101 高水平患者組織中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表達量均低于低水平患者，HSP-70，IL-1β 高水平患者組織中上述各基因表達量均高于低水平患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。

表2 胃癌Hp 陽性組不同血清指標水平患者組織中腫瘤增殖、侵襲基因表達比較(±s)

表2 胃癌Hp 陽性組不同血清指標水平患者組織中腫瘤增殖、侵襲基因表達比較(±s)

組別miR-101 tP HSP-70 tP IL-1β tP高水平低水平高水平低水平高水平低水平n 313736323830增殖基因PIK3CD 2.27±0.58 3.62±0.70 8.554＜0.001 3.46±0.68 2.48±0.57 6.395＜0.001 3.39±0.73 2.51±0.61 5.330＜0.001 C-myc 1.58±0.32 3.29±0.54 15.489 ＜0.001 3.17±0.59 1.77±0.36 11.631 ＜0.001 2.98±0.51 1.91±0.40 21.755 ＜0.001 EZH2 1.28±0.39 3.47±0.62 17.034 ＜0.001 3.31±0.65 1.53±0.36 13.725 ＜0.001 3.09±0.58 1.68±0.43 11.114 ＜0.001侵襲基因UHRF1 1.44±0.43 3.15±0.49 15.146 ＜0.001 2.97±0.52 1.70±0.39 11.278 ＜0.001 2.84±0.47 1.77±0.41 9.853＜0.001 Vav31.19±0.36 2.84±0.45 16.467 ＜0.001 2.69±0.42 1.42±0.33 13.742 ＜0.001 2.52±0.48 1.55±0.31 9.594＜0.001

2.4 胃癌并發(fā)Hp感染患者血清各指標水平與組織中腫瘤增殖、侵襲基因表達關系 Spearman 相關分析可知，胃癌Hp 陽性患者血清miR-101水平與組織中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表達量呈顯著負相關（r=-0.664，-0.709，-0.714，-0.702，-0.687，均P＜0.05），HSP-70，IL-1β水平與組織中PIK3CD，C-myc，EZH2，UHRF1，Vav3 基因表達量呈顯著正相關（rHSP-70=0.629，0.693，0.702,0.685,0.659 ；rIL-1β=0.608,0.672,0.687,0.664,0.636，均P＜0.05）。

2.5 血清各指標與胃癌并發(fā)Hp感染患者生存期的相關性 見圖1～3。隨訪至2021年2月，68 例胃癌并發(fā)Hp感染患者中共有3 例失訪。經Kaplan-Meier 生存分析顯示，HSP-70，IL-1β 高水平患者生存率均低于HSP-70，IL-1β 低水平患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝9.862，8.163，P＝0.002，0.004），miR-101 高水平患者生存率高于低水平患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.669，P＝0.003）。

圖1 不同miR-101水平胃癌患者生存曲線

3 討論

Hp 為一種存活在胃內的微生物，Hp 感染可導致細胞壁缺陷，提升黏附能力，逃脫免疫監(jiān)視，引起胃黏膜慢性損傷，造成炎癥反應與免疫反應，在胃癌發(fā)生、進展中起著重要作用[10-11]。進一步探討Hp 促進胃癌進展的具體機制對胃癌及時、合理診療，改善患者預后具有積極意義。

圖2 不同HSP-70水平胃癌患者生存曲線

圖3 不同IL-1β水平胃癌患者生存曲線

IL-1β 為白細胞介素-1 主要存在形式與傳導途徑，KIM 等[12]研究報道，IL-1β 可與Hp 感染一同參與胃癌致病過程，Hp 根除后胃癌患者血清IL-1β水平可持續(xù)降低。本研究顯示，胃癌Hp 陽性組血清IL-1β水平較高，且其水平與Hp 感染U值呈正相關。表明血清IL-1β和Hp 感染于胃癌病程進展中具有協(xié)同作用機制，Hp 感染可能會促進血清IL-1β 異常表達，促進胃癌發(fā)生、進展。分析原因可能為，Hp 經由感染活性氧簇途徑促使NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 炎癥復合體激活，并促使Yes 相關蛋白-1 核易位，調節(jié)有關信號通路，促進IL-1β表達[13-14]。同時，IL-1β 高表達可刺激其他細胞因子與炎性因子分泌及釋放，加快B 淋巴細胞增殖與分化，促進免疫球蛋白分泌，并可促使血小板生長因子、集落刺激因子形成與T 淋巴細胞激活，增強因細胞免疫引起的組織損傷，造成胃黏膜組織受損，促進胃癌發(fā)生、進展[15-16]?；诖耍狙芯可娣治鲲@示，IL-1β 高水平胃癌Hp 陽性患者生存率較低。提示，IL-1β水平還與胃癌Hp陽性患者預后具有一定關系，通過測定其表達可為疾病診治提供更多參考，利于增加患者臨床獲益。

HSP-70 為熱休克蛋白家族中一員，付保芹等[17]研究報道，胃癌患者血清HSP-70表達可顯著增高，且表達與Hp 感染有關。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌Hp 陽性組血清HSP-70水平較高，且其水平與Hp 感染U 值有關。提示血清HSP-70 可能與Hp 感染協(xié)同促進胃癌發(fā)生、進展。其原因可能為，Hp 感染可影響細胞毒素相關蛋白基因A表達，促使機體應激系統(tǒng)激活，進而影響血清HSP-70表達[18]。同時，相關研究報道，血清HSP-70表達增高可激活下游炎癥反應，影響腫瘤微環(huán)境，引起腫瘤細胞生物學改變，增加癌細胞轉移風險；且能參與B 淋巴細胞瘤-2 基因等癌基因凋亡調控工作；并可誘導Bcl-2相關的X 基因構象變化，阻止應激活化蛋白激酶誘導的Bcl-2 相關X 基因磷酸化，阻滯細胞凋亡；同時，HSP-70表達升高可影響癌細胞中多聚蛋白沉積速度，提升癌細胞膜內側第二信使激活程度，進而促進腫瘤浸潤深度、臨床分期進展；此外，還可減弱胃黏膜上皮細胞基因錯配修復能力，促進癌細胞上皮-間質轉換，進而加速胃癌病情進展[19]。繆孟郡等[20]研究報道，有淋巴結轉移、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者血清HSP-70水平高于無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期患者，與腫瘤淋巴結轉移、臨床分期有關。本研究繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，HSP-70 高水平胃癌Hp 陽性患者生存率較低。也說明HSP-70水平與胃癌Hp 陽性患者預后有關，可為預后評價提供一定參考信息。

miRNA 可靶向調控有關基因表達參與腫瘤細胞分化、增殖與侵襲過程，在惡性腫瘤病程進展中起到致癌或抑癌作用[21]。miR-101 為一種具有抑癌作用的miRNA，黃光墉等[22]研究報道，胃癌患者miR-101表達可顯著降低。本研究中，胃癌Hp 陽性組血清miR-101水平明顯降低，且相關性分析可知，其表達與Hp 感染U 值呈負相關，繪制生存曲線提示，miR-101 高水平患者生存率高于低水平患者。說明血清miR-101 可能與Hp 感染協(xié)同促進了胃癌病程進展，影響患者預后，測定該指標水平可為臨床制定合理治療方案提供一定依據(jù)?？紤]原因為，Hp 感染可促進細胞空泡毒素、尿素酶等物質分泌，增強對胃黏膜組織的刺激，加劇炎癥反應與免疫系統(tǒng)激活程度，進而致使血清miR-101水平降低。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-101 可抑制腫瘤細胞上皮-間質轉化，降低細胞間黏附蛋白表達，抑制腫瘤細胞擴散與轉移，miR-101表達降低可導致機體對腫瘤細胞增殖與轉移抑制作用減弱，促進胃癌發(fā)病、進展[23]。

此外，PIK3CD，C-myc，EZH2 為調控細胞增殖過程促增殖基因，高表達與癌細胞惡性增殖有關。UHRF1，Vav3 為調控細胞侵襲重要基因，高表達可促進癌細胞侵襲過程。本研究顯示，胃癌伴Hp感染患者血清miR-101水平與組織中上述腫瘤增殖、侵襲基因表達量呈負相關，HSP-70，IL-1β水平與組織中上述腫瘤增殖、侵襲基因表達量呈正相關。也提示Hp 感染可誘導血清miR-101，HSP-70，IL-1β 異常表達，促進腫瘤增殖、侵襲。在臨床中應注意檢測Hp 性質與miR-101，HSP-70，IL-1β表達情況，為胃癌診治提供更多參考，改善患者預后。

綜上，胃癌患者并發(fā)Hp感染可促進血清miR-101，HSP-70，IL-1β異常表達，促使腫瘤增殖、侵襲，影響患者預后。但本研究為單中心研究，仍有待將來多中心研究進一步探究。