胡 偉，張 濤，盛尚春，劉 翔，丁貴梅，代 瓊（宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗科，四川宜賓 644000）

膿毒癥（sepsis）是因感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，創(chuàng)傷、感染等是其常見的并發(fā)癥，全球每天約有14 000 人死于其并發(fā)癥[1-2]。膿毒癥救治困難、預(yù)后不良，高發(fā)病率、高死亡率，是危重癥病房常見病[3]。目前臨床上采用液體復(fù)蘇、抗感染及器官支持等治療，但患者的死亡率仍然很高，可見尋找一種新的治療方法尤為重要。膿毒癥的發(fā)病機制較為復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，其會激活機體中的炎性細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，在膿毒癥發(fā)病時通過調(diào)控Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducer and activvator of transcription，JAK/STAT）信號通路參與膿毒癥的發(fā)生[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT 通路可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子信號通路，且STAT1和STAT3 參與大部分炎癥侵襲細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，影響膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展[6]。有文獻(xiàn)報道，抑制JAK/STAT信號通路可減輕膿毒癥大鼠的重要臟器功能損傷[7]。1型胰島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）是一種跨膜受體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化增殖、機體免疫等生物學(xué)活性[8]。胰島素樣生長因子-1/2（insulin-like growth factor -1/2，IGF-1/2）是IGF-1R的同源配體，當(dāng)IGF-1R 被IGF-1/2或胰島素激活時，自身會發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡[9]。但I(xiàn)GF-1R 對JAK/STAT信號通路的調(diào)控，及對膿毒癥大鼠的作用機制尚不明確，因此本文通過探究IGF-1R的作用機制，為臨床治療膿毒癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 60 只雄性大鼠均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。大鼠體質(zhì)量220～250g，健康級，大鼠均飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內(nèi)，室溫20～24℃，相對濕度40%～50%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)1 周新環(huán)境。本次實驗經(jīng)我院動物倫理審批同意。

1.2 試劑與儀器 IGF-1R，貨號：HZ5445（ProsPec公司）；兔抗大鼠IGF-1 單克隆抗體（北京沃凱生物科技有限公司）；兔抗大鼠JAK1（批號：K0303）和STAT3（批號：C1303）單克隆抗體（廣州翔博生物科技有限公司）；TG20 臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ts-100b 恒溫?fù)u床（江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 膿毒癥大鼠模型制備及分組：將60 只大鼠按照數(shù)字隨機法隨機分為三組，分別為假手術(shù)組(sham組)、膿毒癥大鼠模型組（sepsis 組）和膿毒癥大鼠模型給予IGF-1R 干預(yù)組（IGF-1R 組），每組20只。本文以盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)為參照制備膿毒癥大鼠模型。10g/dl 水合氯醛麻醉大鼠并固定，沿腹部中線切1.5 cm的小口，結(jié)扎盲腸，注意避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管。分3 次穿刺盲腸，用留置的橡皮片貫穿盲腸，完成后將盲腸回歸原來位置，逐層縫合皮膚。Sham 組大鼠僅開腹但不結(jié)扎盲腸。為防止大鼠休克立即皮下注射林格氏液10 ml，將大鼠放回籠內(nèi)，給予充足的水分。

1.3.2 給藥：造模成功后，IGF-1R 組經(jīng)側(cè)腦室定位注射藥物，麻醉大鼠后固定頭部。剔除頭顱正中毛發(fā)并消毒，從右耳窩線中線開始向鼻側(cè)做中切線，切1.5 cm的小口。分離各組大鼠皮下筋膜和骨膜，充分暴露前囟，在前囟向后0.8 mm、中縫靠右1.5 mm 處鉆一小孔，以顱骨上緣為起點，在鉆孔處將針垂直向下插入4.5 mm，同時向右側(cè)腦室注射10 μl IGF-1R，保證藥物流速為1 μl/min，注射完成20 min 后再緩慢拔出注射器，縫合消毒。Sham 組和sepsis 組大鼠均于同等位置注射10 μl的生理鹽水干預(yù)，一天一次，連續(xù)注射7 天。

1.3.3 標(biāo)本采集：消毒大鼠皮膚后開腹，完全分離腹主動脈，取腹主動脈血5 ml 至離心管中，12 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存待測。消毒皮膚后開腹，取出肺組織，置于消毒的凍存管中，放置-80 ℃環(huán)境中保存，待用。

1.3.4 免疫熒光染色檢測大鼠肺組織中IGF-1R 陽性細(xì)胞比例:給藥干預(yù)后麻醉各組大鼠，消毒開胸取肺組織，將組織用4g/dl 多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片機切成5 μm的薄片，自來水沖洗，用枸櫞酸緩沖液修復(fù)組織2 min，待切片組織冷卻后沖洗，用畫圈筆畫圈。過氧化氫將組織在黑暗的環(huán)境中封閉20 min，PBS 溶液洗滌3 次，室溫封閉1 h。每張切片加入50 μl的IGF-1R 抗體，4 ℃孵育組織過夜，PBS 再次清洗5 次。避光環(huán)境中加入二抗，室溫孵育6 h 后再次清洗3 次，避光環(huán)境下將DAPI 加入，避光孵育11 min，PBR 溶液清洗3次后，用甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 ELISA 檢測血清中IL-6和TNF-α 含量:分別取出三組大鼠的肺組織，將組織放置到均漿器中，同時把3 倍體積的磷酸緩沖液加入到均漿器中，制成組織均漿。離心機離心組織均漿，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，檢測血清中IL-6和TNF-α 含量。

1.3.6 HE 染色檢測肺組織病理形態(tài)變化：取各組大鼠左肺上葉組織，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，用石蠟切片將組織切成厚度為6 μm的薄片，將組織進(jìn)行常規(guī)的HE 染色后，每張切片隨機取4 個清晰的視野于顯微鏡下觀察。

1.3.7 TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡：肺組織與蛋白酶K室溫孵育，切片浸入TUNEL 反應(yīng)液中，后PBS 沖洗3 次。過氧化氫沖洗淬滅酶活性，后聯(lián)合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯胺覆蓋，凋亡細(xì)胞為棕黃色，隨機選擇5 個視野下的細(xì)胞觀察凋亡率。

1.3.8 免疫印跡檢測組織中p-JAK1和p-STAT3 蛋白表達(dá)：分別取三組大鼠50 mg 肺組織，用WB 裂解液裂解，研磨組織30 min，離心機離心，12 000r/min 離心5 min，收集上清液檢測蛋白濃度，在每孔中加入50 μg的蛋白樣品，根據(jù)蛋白濃度計算樣本體積。把濃縮的SDS-PAGE 緩沖液加入到上清液中，加熱上清液，5 min 后在預(yù)制的膠孔中把蛋白樣本加入，在封閉的環(huán)境中孵育。1h 后加入一抗，TBST 溶液將蛋白樣品清洗3 次，曝光成像后分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行本實驗的統(tǒng)計學(xué)分析，滿足正太性分布及方差的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；兩組間數(shù)據(jù)用成組設(shè)計資料的t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織中IGF-1R 陽性細(xì)胞比例 組織中IGF-1R 陽性細(xì)胞在sham 組（58.32%±5.21%）、sepsis 組（21.65%±8.73%）和IGF-1R 組（46.58%±6.72%）占比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=141.7，P＜0.000 1）。和sham 組相比，sepsis 組大鼠肺組織中IGF-1R 陽性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例減少（t=16.13，P＜0.000 1）；IGF-1R 組大鼠肺組織中IGF-1R 陽性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例較sepsis 組增加（t=10.12，P＜0.000 1），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α 含量比較 見表1。 血清中IL-6 在sham 組、sepsis 組和IGF-1R 組的含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.23，P＜0.000 1）；血清中TNF-α 在sham 組、sepsis組和IGF-1R 組的含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=130.7，P＜0.000 1）。和sham 組相比，sepsis組血清中IL-6和TNF-α 含量增加；IGF-1R 組血清中IL-6和TNF-α 含量較sepsis 組減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)義（P＜0.000 1）。

表1 各組大鼠血清IL-6,TNF-α 含量（±s,pg/ml）

表1 各組大鼠血清IL-6,TNF-α 含量（±s,pg/ml）

項 目sham 組①sepsis 組②IGF-1R 組③① vs ②③ vs ②t P tP IL-64.35±2.019.81±4.265.11±2.575.18＜0.000 14.23＜0.000 1 TNF-α2.31±1.1214.15±3.266.58±2.1521.98＜0.000 112.01＜0.000 1

2.3 各組大鼠肺組織病理變化比較 見圖1。Sham組大鼠肺組織正常，沒有明顯的病理改變；sepsis組肺組織有大量的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯厚于sham 組，部分肺組織完整性受到破壞。和sepsis組大鼠相比，IGF-1R 組大鼠肺組織得到了明顯的改善。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE 染色，×100）

2.4 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率比較 見圖2。細(xì)胞凋亡率在sham 組（6.35%±2.51%）、sepsis 組（37.84%±6.62%）和IGF-1R 組（22.71%±4.28%）間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=217.4，P＜0.000 1）。和sham 組相比，sepsis 組細(xì)胞凋亡率增加（t=19.89，P＜0.000 1）；和sepsisi 組相比，IGF-1R 組大鼠細(xì)胞凋亡率降低（t=8.583，P＜0.000 1），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL 染色，×100）

2.5 各組大鼠肺組織中p-JAK1和p-STAT3 蛋白表達(dá)比較 肺組織中p-JAK1 在sham 組（0.15±0.11）、sepsis 組（0.33±0.16）和IGF-1R 組（0.17±0.13）中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.70，P=0.000 1）。肺組織中p-STAT3 在sham 組（0.12±0.10）、sepsis組（0.28±0.15）和IGF-1R 組（0.19±0.12）中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.230，P=0.000 7）。和sham 組相比，sepsis 組肺組織中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)增加（t=4.146,3.969,P=0.000 2,0.000 3）；IGF-1R 組大鼠肺組織中p-JAK1和p-STAT3 蛋白低于sepsis 組（t=3.471,2.095,P=0.001 3,0.042 9）。

3 討論

膿毒癥的高發(fā)病率、高死亡率嚴(yán)重威脅患者的生命健康[10-11]。膿毒癥的病理性表現(xiàn)以急性炎癥為主，包括TNFα，IL-1β和IL-6 等炎癥介質(zhì)過度釋放[12]。雖然目前抗生素的完善一定程度提高了膿毒癥患者的病死率，但對復(fù)雜的膿毒癥發(fā)病機制認(rèn)識尚不全面，持續(xù)炎癥、免疫抑制等新問題也逐漸出現(xiàn)，因此降低膿毒癥患者的病死率和發(fā)病率是目前臨床亟待解決的問題。IGF-1 主要由肝臟分泌，其會通過內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌等不同的分泌方式和靶細(xì)胞表面的1 型胰島素樣因子受體（IGF-1R）相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)外周組織、細(xì)胞的生理和病理變化。有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1R 能調(diào)節(jié)膿毒癥患者機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，但其具體的作用機制尚不明確，因此本研究對膿毒癥大鼠給予IGF-1R 干預(yù)治療，研究其對膿毒癥的作用機制[13]。

膿毒癥早期會釋放大量的炎癥因子且浸潤到細(xì)胞中，減少中性粒細(xì)胞的凋亡，損傷毛細(xì)血管及血管功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致肺間質(zhì)嚴(yán)重水腫、蛋白出現(xiàn)滲漏等多種不同機制的發(fā)生，和膿毒癥致急性肺損傷有密切關(guān)系[14]。有研究顯示，機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)失調(diào)是導(dǎo)致膿毒癥所致肺損傷的主要發(fā)病機制，其中IL-6 是最主要的一種內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子，可啟動機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，還能對炎癥反應(yīng)進(jìn)行催化和放大，有效判斷炎癥程度，進(jìn)而影響機體的炎性反應(yīng)。有學(xué)者通過對膿毒癥患者體內(nèi)炎癥因子檢測時發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α 含量增加，抑制IGF-1的合成，降低機體血液中IGF-1水平，增加膿毒癥發(fā)生時的細(xì)菌移位，最終加重膿毒癥患者病情[15]。本研究結(jié)果顯示膿毒癥大鼠血清中IL-6和TNF-α 含量升高，IGF-1 陽性表達(dá)降低，細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡；IGF-1R 干預(yù)后膿毒癥大鼠血清中的炎癥因子減少，且細(xì)胞凋亡率也降低，提示IGF-1R 對膿毒癥所致肺損傷有一定治療作用。TIAN 等[16]研究證實，在膿毒癥患兒中IGF-1表達(dá)降低，并在病程中保持穩(wěn)定，但血糖變化和IGF-1 沒有明顯的聯(lián)系。

有研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路是炎癥反應(yīng)中最顯著的細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)之一[17]。白介素、干擾素、腫瘤壞死因子招募JAK 蛋白結(jié)合于受體表位，使JAK 蛋白彼此靠近而相互磷酸化激活，激活的JAK進(jìn)一步對STAT 蛋白磷酸化，致使其二聚化入核，識別特定的DNA 序列，調(diào)控靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換和T 淋巴細(xì)胞增殖分化，并通過釋放大量的炎癥因子和趨化因子，使得巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18-19]。JAK/STAT 通路參與炎癥免疫反應(yīng)的應(yīng)答，對膿毒癥所致急性肺損傷的機制中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。

有研究證實，JAK/STAT信號通路可調(diào)節(jié)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型的急性肺損傷，同時抑制JAK 或STAT 可減輕嚴(yán)重膿毒癥所致的急性肺損傷和致死性[20]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠組織中JAK/STAT信號被激活，促進(jìn)了p-JAK1和p-STAT3表達(dá)；IGF-1R 干預(yù)后可抑制JAK/STAT信號，進(jìn)而減輕膿毒癥所致急性肺損傷，提示抑制JAK/STAT通路的激活可減輕膿毒癥所致的急性肺損傷。XIE等[21]通過對大鼠實驗研究證實，電針可抑制膿毒癥最大數(shù)炎癥介質(zhì)的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，其機制是通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3 通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，IGF-1R 可對JAK/STAT信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，降低血清中炎癥因子的含量，進(jìn)而改善膿毒癥所致的急性肺損傷。但由于本研究選取的樣本數(shù)量和動物有限，使本文存在一定的局限性。在今后的實驗中，會加大樣本的研究數(shù)量，且進(jìn)行人體實驗研究，以進(jìn)一步驗證IGF-1R 在膿毒癥中的應(yīng)用價值。