伍義文，曹健斌，黃維佳，何凌云（柳州市人民醫(yī)院心胸外科，廣西柳州 545006）

非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer cells,NSCLC）是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，是根據(jù)腫瘤主體的生物學(xué)特性和對(duì)治療的敏感性來(lái)進(jìn)行區(qū)分的，大約占肺癌的80%～85%[1]。早期肺癌的發(fā)病人群大多是男性，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，女性非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病比例也逐年增加，并逐漸趨于年輕化[2]。因此，探索非小細(xì)胞肺癌靶向分子標(biāo)志物，闡明其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于臨床治療非小細(xì)胞肺癌具體方案的制定有十分重要的意義。甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase-like 3,METTL3）是哺乳動(dòng)物N6 腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分，在mRNA，tRNA，rRNA，microRNA 前體和長(zhǎng)非編碼RNA等多種基因中對(duì)N6甲基腺苷（m6A）進(jìn)行修飾，可作為m6A甲基化的編碼器，通過(guò)不同的調(diào)控途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)METTL3可以通過(guò)甲基化CCNE1 mRNA 3’非翻譯區(qū)（UTR）中的m6A 位點(diǎn)來(lái)促進(jìn)直腸癌細(xì)胞增殖，下調(diào)METTL3和相關(guān)細(xì)胞周期蛋白cyclin E1的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，是治療直腸癌的一種有效策略[5]。miR-127 作為具有調(diào)控作用的非編碼微小RNA，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。如研究百令膠囊通過(guò)下調(diào)miR-127 抑制巨噬細(xì)胞的增殖和吞噬作用，減少炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-1和IL-6的釋放，從而減輕狼瘡性腎炎的進(jìn)一步發(fā)展[7]。目前，關(guān)于METTL3和miR-127 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及調(diào)控關(guān)系鮮有報(bào)道，故本研究著重分析了METTL3和miR-127 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及它們之間的關(guān)系，探討METTL3介導(dǎo)miR-127對(duì)非小細(xì)胞肺癌自噬的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827，A549和H460（均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibico 公司）；PCR 引物（上海生工生物工程公司合成）；RNA 提取盒，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；吖啶橙，Lyso-Tracker Red（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PTEN,p-AKT,p-mTOR,ULK1,Beclin-1抗體（Cell signaling technology 公司）；LipofectAMINE 2000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：BEAS-2B，HCC827，A549和H460 細(xì)胞均用10ml/dl 胎牛血清配置的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃ 5ml/dl CO2孵育箱中，用80%的細(xì)胞密度進(jìn)行傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)至取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)各細(xì)胞系中METTL3和miR-127的表達(dá)：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行總RNA的提取，提取結(jié)束后吸取2 μl RNA 樣品用來(lái)檢測(cè)其純度，A260nm/A280nm的比值一般在1.6～1.8 之間即可；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA ，反應(yīng)體系20 μl ，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃ 5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）；用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μl，其中SYBR Premix ExTaq Ⅱ（2×）10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μl，ddH2O 5.5 μl，實(shí)時(shí)PCR 條件：94 ℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，循環(huán)35 次，4℃保存?zhèn)溆?；采用熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，分別以β-actin和U6 作為METTL3和miR-127 內(nèi)參，根據(jù)RT-PCR 反應(yīng)結(jié)果中的Ct值，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析目的基因相對(duì)表達(dá)。

1.3.3 METTL3和miR-127 相關(guān)性研究：利用Linked Domic 數(shù)據(jù)庫(kù)查找在肺癌中與miR-127表達(dá)具有相關(guān)性的靶基因，分析其與METTL3 間的相關(guān)性。檢索文獻(xiàn)篩選出miR-127與自噬相關(guān)的下游因子，構(gòu)建METTL3介導(dǎo)miR-127調(diào)控非小細(xì)胞肺癌自噬的通路。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，隨機(jī)分為三組，即轉(zhuǎn)染沉默載體（METTL3-siR 組）、陰性表達(dá)載體（NC-siR 組）及空白對(duì)照（Control 組），按LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h 后換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后采用qRT-PCR 法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染情況。

1.3.5 抑制METTL3表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬的影響：吖啶橙染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)液，加入用PBS 稀釋至0.01%的吖啶橙染液，室溫避光染色5 min，熒光顯微鏡下520 nm 激發(fā)光觀察酸性自噬小體并拍照。Lyso-Tracker Red 染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)液，加入50nmol/L的Lyso-Tracker Red 染料，37℃條件下避光染色1 h，PBS 潤(rùn)洗2 次后，加入Hoechst 33342染液避光復(fù)染20 min，PBS 清洗后熒光顯微鏡觀察自噬溶酶體數(shù)量并拍照。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解后，4℃，12 000 r/min 離心取上清液，BCA 試劑盒檢測(cè)樣品中蛋白濃度。若蛋白濃度相差過(guò)大，需要將樣品的蛋白濃度調(diào)至一致。將調(diào)整后樣品加入loading buffer，混勻煮沸10 min，恢復(fù)至室溫后離心，配置8%分離膠，在分離膠上面距頂端3 cm 處加入濃縮膠，加入蛋白樣品后，80 V 濃縮，120 V分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)NC 膜2 h，脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST 洗膜、加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST 洗膜三次后加入二抗，室溫孵育2 h，PBST 漂洗3 次后采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，凝膠成像儀觀察拍照，并用Image-J 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常肺上皮細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中METTL3和miR-127表達(dá)情況 qRT-PCR 檢測(cè)顯示，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HCC827，A549和H460中METTL3相對(duì)表達(dá)分別為1.35±0.17，1.54±0.11，1.78±0.21，較正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 中表達(dá)（0.91±0.11）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.037，P=0.002）。HCC827，A549，H460 細(xì)胞系中miR-127 相對(duì)表達(dá)分別為1.56±0.21，1.85±0.19和2.11±0.25，較正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 中表達(dá)（1.02±0.20）亦顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.152，P=0.005）。

2.2 METTL3和miR-127 相關(guān)性研究 見(jiàn)圖1。經(jīng)Linked Domics 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)，METTL3與miR-127在肺癌中表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.452，P＜0.001）。

圖1 肺癌中METTL3和miR-127表達(dá)相關(guān)性

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 轉(zhuǎn)染METTL3 抑制劑培養(yǎng)48 h 后，qRT-PCR 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，METTL3-siR 組METTL3 基因表達(dá)水平為0.61±0.15，較Control組（1.71±0.28）和NC-siR 組（1.65±0.19）顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.357，P＜0.001）。METTL3-siR 組細(xì)胞中miR-127表達(dá)水平為0.48±0.15，較Control 組（2.02±0.33）和NC-siR 組（1.97±0.25）miR-127表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=105.216，P＜0.001），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，并且抑制METTL3表達(dá)可下調(diào)miR-127表達(dá)水平。

2.4 抑制METTL3表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬的影響 吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)，說(shuō)明抑制METTL3表達(dá)，使得自噬小泡增多，見(jiàn)圖2A；Lyso-Tracker Red 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL3-siR 組出現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明自噬小體與細(xì)胞內(nèi)溶酶體結(jié)合，形成的自噬溶酶體增多見(jiàn)圖2B。

圖2 抑制METTL3表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬的影響

2.5 METTL3介導(dǎo)miR-127 對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)表明，與Control 組和NC-siR 組相比，METTL3-siR 組細(xì)胞中PTEN，ULK1，Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.420～175.615，均P＜0.001），p-AKT和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=148.781，87.147，均P＜0.001），見(jiàn)圖3和表1。

表1 抑制METTL3 對(duì)miR-127 下游自噬蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 抑制METTL3 對(duì)miR-127 下游自噬蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：各時(shí)間點(diǎn)③組與①②組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P ＜0.05；①②組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

類(lèi)別Control①NC-siR 組②METTL3-siR 組③FP PTEN0.59±0.0170.62±0.0211.17±0.009112.165＜0.001 p-AKT1.20±0.0231.14±0.0170.60±0.012148.781＜0.001 p-mTOR0.95±0.0260.91±0.0280.53±0.01987.147＜0.001 ULK10.63±0.0270.68±0.0311.22±0.030175.615＜0.001 Beclin10.44±0.0120.50±0.0150.87±0.02662.420＜0.001

圖3 Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和死亡率位列所有癌癥首位，由于其早期癥狀與普通肺炎相似，不易被重視，診斷時(shí)往往已經(jīng)發(fā)展成中晚期，導(dǎo)致錯(cuò)失最佳治療時(shí)間，術(shù)后5年生存率較低，嚴(yán)重威脅著患者的預(yù)后[8-9]。METTL3 作為RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，控制m6A的修飾以影響mRNA的生物合成、衰變和翻譯，迄今為止已經(jīng)有許多研究證實(shí)了METTL3 調(diào)控miRNA 參與腫瘤進(jìn)程[10]。BI等[11]探討了METTL3介導(dǎo)的miR-126-5p 在卵巢癌進(jìn)展中的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低METTL3 抑制了miR-126-5p 上調(diào)PTEN的作用，阻止了PI3K/Akt/mTOR 途徑的激活，從而抑制了卵巢癌的發(fā)展，這些發(fā)現(xiàn)突出了未來(lái)卵巢癌治療的潛在目標(biāo)以及m6A 修飾介導(dǎo)的致瘤機(jī)制。ZHA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)METTL3 過(guò)表達(dá)以微處理器蛋白質(zhì)DGCR8 依賴(lài)性的方式增加了RPE 細(xì)胞中miR-25-3p的水平，此外PTEN 可能受到miR-25-3p的負(fù)調(diào)控，而METTL3的過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向miR-25-3p/PTEN 軸而增加了磷酸化的Akt（p-Akt）水平引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，共同拯救了高糖處理的RPE 細(xì)胞中的細(xì)胞活力。SUN等[13]研究了METTL3 在胃癌中對(duì)非編碼RNA的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL3 在胃癌患者中呈高表達(dá)，且預(yù)后差、惡性程度高，其機(jī)制可能是依賴(lài)于m6A/DGCR8的途徑促進(jìn)了miR-17-92的加工，進(jìn)而通過(guò)靶向PTEN 激活了AKT/mTOR 通路。

miR-127 作為miRNA的一員，在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分化、凋亡和自噬等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-127 在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中均異常高表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、侵襲及上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其調(diào)控機(jī)制可能是miR-127 作用于NF-κB 通路，影響肺癌的發(fā)生發(fā)展[15]。ZHANG 等[16]研究了新生兒缺血缺氧損傷中miR-127 引起異常自噬的作用機(jī)制，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p 敲除的新生兒損傷皮質(zhì)中自噬相關(guān)蛋白ATG12，P62，Beclin-1和LC3II的表達(dá)顯著降低，自噬液泡消失；此外miR-127-3p 對(duì)自噬過(guò)程中另一個(gè)至關(guān)重要的分子CISD1表達(dá)具有特定的調(diào)節(jié)作用，CISD1的過(guò)表達(dá)有效抑制了損傷腦中的自噬細(xì)胞死亡和生理功能障礙，靶向CISD1信號(hào)的miR-127-3p 可能被認(rèn)為是預(yù)防和治療新生兒缺血缺氧損傷的新策略。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTEN 是miR-127的直接結(jié)合位點(diǎn)，miR-127 高表達(dá)可以負(fù)向調(diào)控PTEN表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其下游因子AKT 起到活化作用，AKT/mTOR 通路作為細(xì)胞自噬的經(jīng)典途徑，對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展起到催化作用，因此通過(guò)降低miR-127表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬和凋亡,可能是一種更特異、更有效治療癌癥的新方法[17]。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，METTL3和miR-127 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高，兩者在肺癌中呈正性共表達(dá)，提示METTL3和miR-127與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，扮演促癌基因角色。經(jīng)轉(zhuǎn)染介導(dǎo)敲低METTL3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)METTL3和miR-127表達(dá)水平均顯著下降，說(shuō)明利用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞是安全可行的，并且抑制METTL3 確實(shí)可以下調(diào)miR-127，進(jìn)一步說(shuō)明兩者之間存在一定的介導(dǎo)關(guān)系。另有研究通過(guò)吖啶橙染色和Lyso-Tracker Red 染色發(fā)現(xiàn)METTL3-siR 組細(xì)胞內(nèi)自噬小體增多，與溶酶體結(jié)合形成的自噬溶酶體也增多，提示抑制METTL3表達(dá)可以促使細(xì)胞發(fā)生自噬，誘導(dǎo)凋亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，METTL3-siR 組PTEN表達(dá)升高，原因可能與PTEN作為miR-127的直接結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，抑制METTL3導(dǎo)致miR-127 下調(diào)，進(jìn)而上調(diào)PTEN表達(dá)；AKT 作為PTEN的下游因子，激活PTEN 可以抑制AKT 磷酸化水平，進(jìn)而下調(diào)p-mTOR，ULK1和Beclin1 是mTOR 下游的自噬蛋白，表達(dá)水平與p-mTOR 呈負(fù)相關(guān)，提示通過(guò)抑制METTL3表達(dá)來(lái)下調(diào)miR-127，進(jìn)而激活PTEN/AKT/mTOR 通路是促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬的重要途徑。

綜上所述，METTL3和miR-127 在非小細(xì)胞肺癌中起到促癌作用，抑制METTL3表達(dá)可以下調(diào)miR-127，促使癌細(xì)胞發(fā)生自噬，其調(diào)控機(jī)制可能與激活PTEN/AKT/mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。但本研究還存在一定的局限性，首先只做了體外實(shí)驗(yàn)，METTL3和miR-127 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證；其次miR-127 是否還通過(guò)其他途徑來(lái)調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)行深入研究，以期為非小細(xì)胞肺癌的治療提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。