張明威，陳 陽，王 靜，葛京平，張春妮，汪俊軍，王 成

（中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院a．檢驗(yàn)科；b．泌尿外科，南京210002）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種原發(fā)于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第二位，死亡率居第一位，且仍呈現(xiàn)出明顯增長趨勢，防治形勢極為嚴(yán)峻[1]。RCC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床亦缺乏有價(jià)值的血清學(xué)標(biāo)志物，因此，尋找和鑒定有價(jià)值的血清學(xué)標(biāo)志物仍是診治亟需解決的重要臨床問題[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子核糖核酸，與多種惡性腫瘤包括RCC 密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著“原癌基因”和“抑癌基因”的雙重角色。人外周血中也存在豐富、穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，RCC患者特定變化的miRNA 具備作為RCC 新型非侵入性分子標(biāo)志物潛能。目前，已鑒定出多種在RCC患者外周血中顯著變化的miRNA。miR-378定位于人5 號染色體（5 號染色體:149,732,825-149,732,890），報(bào)道顯示其在RCC患者外周血中顯著變化，但不同研究結(jié)果呈現(xiàn)出明顯的不一致甚至相互矛盾，因此其變化趨勢及臨床價(jià)值仍有待進(jìn)一步證實(shí)和探討[3-6]。近年來研究顯示，外周血循環(huán)miRNA 可包裹于細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），且EVs miRNA的檢測較循環(huán)miRNA 更具價(jià)值[7]，但目前RCC患者外周血EVs中miR-378的變化及臨床價(jià)值尚不清楚。同時(shí)，RCC 組織和EVs 中miR-378的表達(dá)變化或可為前期研究結(jié)果不一致提供新的線索。因此，本文針對RCC患者組織和外周血EVs 中miR-378的表達(dá)變化進(jìn)行檢測和分析，并對其功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期初步明確患者外周血及外周血EVs 中miR-378 變化、價(jià)值及潛在的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月～ 2018年12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科初收并行腎癌根治術(shù)的RCC患者癌組織及對應(yīng)的癌旁組織40 對，所有患者手術(shù)切除樣本均進(jìn)行病理學(xué)確診并按照Furhman分級標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤進(jìn)行分級，其中Ⅰ級8 例、I～I(xiàn)I級5 例、Ⅱ級16 例、II～I(xiàn)II 級2 例、Ⅲ級3 例、Ⅳ級1 例及無法分級組織5 例；同時(shí)，收集RCC患者（男性32 例，女性28 例，年齡57.4 ± 12.8 歲）及年齡、性別匹配的健康對照（男性34 例，女性26 例，年齡59.6 ± 12.3 歲）血清標(biāo)本各60 例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診，排除腎囊腫、腎良性腫瘤及其他腎臟疾病。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇（上海化學(xué)試劑公司）；酸性酚（美國Sigma-Aldrich 公司）；3 mol/L（pH=5.5）醋酸鈉（美國Ambion公司）；miRNA 檢測探針及引物（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ExoQuick exosome 提取試劑盒ExoQuick-TC（美國SBI 公司）；DEPC 水（美國Sigma-Aldrich 公司）；PCR 試劑包括5 ×AMV buffer，10 mmol/LdNTP，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，10 × PCR buffer,25mmol/L MgCl2，rTaq DNA 聚合酶（均購自大連TAKARA 公司）。5418 型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Tissuelyser-48全自動(dòng)樣品自動(dòng)研磨儀（上海凈信科技公司）；Nanodrop2000 超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；2720 型PCR 儀，7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystem 公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織RNA 提取：組織標(biāo)本離體30 min 內(nèi)迅速冷凍于液氮，后置于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。取黃豆粒大小組織放入1.5 ml 除酶Eppendorf 管中，然后加入1.0 ml Trizol 試劑，運(yùn)用Tissuelyser-48 充分研磨后加入200 μl 氯仿，并按照Trizol 試劑說明書后續(xù)步驟提取組織RNA。RNA 溶于20μl DEPC水后用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至0.5μg/μl 待用。

1.3.2 血清EV分離：RCC患者及對照血清標(biāo)本用真空生化管采集空腹靜脈血3～5 ml，1 500 g 離心10 min 后取上清置于-80℃冰箱留存待用。血清EVs分離采用ExoQuick exosome 提取試劑盒并按照試劑盒操作說明書，從100 μl 血清中分離EVs后重懸于25μl DEPC 水中待用。

1.3.3 EVs RNA 提取：血清EVs RNA 提取采用課題組前期建立的酸性酚/氯仿一步法進(jìn)行，提取的RNA 溶于20μl DEPC 水后保存于-80℃冰箱待用[6]。

1.3.4 miRNA水平檢測：組織和血清EVs miRNA水平檢測采用基于TaqMan 水解探針的RT-qPCR方法進(jìn)行，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄PCR，RT-qPCR 反應(yīng)體系和PCR 參數(shù)設(shè)置參照課題組前期研究[6]。組織miRNA的水平測定以U6 為內(nèi)參，表達(dá)水平以2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁正常組織；血清EV miRNA的水平測定以miR-16 為內(nèi)參，表達(dá)水平以2-ΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtmiR-16。

1.3.5 miRNA 靶基因及功能預(yù)測：miRNA 靶基因預(yù)測采用在線軟件TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 進(jìn)行，取四種軟件預(yù)測靶基因交集后進(jìn)一步采用在線軟件Metascape分析miRNA 靶基因參與的生物學(xué)功能、調(diào)控通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析和繪圖采用Graphpad 8.0 軟件。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M(P25,P75)]表示，RCC 癌組織和對應(yīng)的癌旁正常組織miRNA表達(dá)水平比較采用wilcoxon 配對秩和檢驗(yàn)，RCC患者與健康對照血清EVs miRNA 組間比較采用M-U檢驗(yàn)。運(yùn)用ROC 曲線分析組織和血清EVs miRNA水平對于RCC的輔助診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCC 組織中miR-378表達(dá)變化 qRT-PCR 測定結(jié)果顯示，40 例患者組織中，與對應(yīng)的癌旁正常組織相比，miR-378的表達(dá)水平在31 例RCC 組織中呈現(xiàn)降低趨勢。miR-378 在RCC 癌組織中相對含量為0.050(0.016，0.137)，在癌旁正常組織為0.134(0.054,0.546)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.481，P=0.003）。

2.2 RCC患者血清EVs 中miR-378表達(dá)變化 qRTPCR 測定結(jié)果顯示，RCC患者血清EVs 中miR-378相對含量為8.295(4.930,15.60)，健康對照相對含量為3.501(2.005,6.853)，RCC患者EVs miR-378水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=850，P＜0.001）。

2.3 組織和血清EVs miR-378 診斷RCC的ROC曲線分析 見圖1。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，組織和血清EVs miR-378 診斷RCC的ROC 曲線下面積分別為0.665（95% CI：0.544～0.786）和0.764（95%CI：0.680～0.848）。組織miR-378的最佳診斷臨界值為0.0714，敏感度和特異度分別為62.50%，67.50%；血清EVs miR-378的最佳診斷臨界值為5.137，敏感度和特異度分別為75.00%，65.00%。

圖1 RCC 癌組織和血清EV miR-378 診斷RCC的ROC 曲線

2.4 miR-378 靶基因及其調(diào)控通路生物信息學(xué)分析 見圖2。運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 預(yù)測miR-378 可調(diào)控的靶基因數(shù)目分別為5 497，8 035，388和653 種，四種數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-378 共同靶基因?yàn)?5 種（圖2A）。進(jìn)一步通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對35 種共同預(yù)測靶基因進(jìn)行功能注釋和富集通路分析，結(jié)果顯示miR-378 靶基因主要與基因轉(zhuǎn)錄、分解代謝、細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)和蛋白激酶活力調(diào)節(jié)等RCC 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的調(diào)控通路相關(guān)（圖2B）。

圖2 miR-378 生物信息學(xué)分析

3 討論

RCC 尚缺乏有價(jià)值的血清學(xué)分子診斷標(biāo)志物，而循環(huán)miRNA 具備作為RCC 非侵入性血清學(xué)分子標(biāo)志物潛能，其中循環(huán)miR-378 在RCC患者外周血中變化報(bào)道較多，但不同研究報(bào)道結(jié)果不一致，miR-378 作為RCC 新型分子標(biāo)志物價(jià)值有待進(jìn)一步探討。最新研究表明，血清EVs miRNA 可來源于病變組織或細(xì)胞主動(dòng)分泌，其對于疾病診斷更具價(jià)值。本研究針對RCC患者外周血miR-378 變化報(bào)道不一致問題，通過對RCC 組織中miR-378的變化和臨床價(jià)值進(jìn)行探討，并對血清EVs miR-378水平進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)miR-378 在RCC 組織中表達(dá)降低，而在血清EVs 中水平顯著升高，組織和血清EVs 中miR-378水平測定均可作為RCC 輔助診斷分子標(biāo)志物，其中血清EVs miR-378的測定更具價(jià)值。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-378 可參與RCC 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的通路調(diào)控。

循環(huán)miR-378 具備成為RCC 診斷標(biāo)志物的潛能，但不同報(bào)道結(jié)果不一致。REDOVA 等[3]和FEDORKO 等[4]研究組發(fā)現(xiàn)，miR-378 在RCC患者血清中水平顯著升高，可作為RCC 診斷分子標(biāo)志物。HAUSER 等[5]則發(fā)現(xiàn)血清miR-378的水平在RCC患者和對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-378 在早期RCC患者血清中水平顯著降低，是RCC 早期輔助診斷潛在的新型分子標(biāo)志物[6]。報(bào)道顯示，腫瘤患者特定循環(huán)miRNA主要來源于腫瘤組織和細(xì)胞，對腫瘤組織miRNA表達(dá)測定可為上述不一致結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8]。本研究針對RCC 組織中測定結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-378 在RCC 組織中表達(dá)水平明顯降低，與早期RCC患者血清中miR-378的變化一致。研究顯示，RCC 組織中miR-378的表達(dá)與腫瘤分期密切相關(guān)，早期（T1 期）RCC 組織中miR-378表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，而中晚期（T2/T3）RCC組織中miR-378表達(dá)明顯高于癌旁正常組織[9]。結(jié)合課題組前期研究及本研究結(jié)果，我們推測RCC患者組織和血清中miR-378的表達(dá)與患者腫瘤分期密切相關(guān)，早期患者降低，中晚期患者升高，這可能是不同研究結(jié)果矛盾的潛在原因，也進(jìn)一步提示組織和血清中降低的miR-378 可作為早期RCC患者輔助診斷分子標(biāo)志物。

血清EVs miRNA 可來源于病變組織或細(xì)胞主動(dòng)分泌，其水平變化可精準(zhǔn)反映病變部位的動(dòng)態(tài)病理變化，對于腫瘤的診斷較組織或循環(huán)miRNA 更具價(jià)值[10]。本研究針對RCC患者血清EVs miR-378的表達(dá)水平測定結(jié)果顯示，與RCC 組織中miR-378表達(dá)降低不同，RCC患者血清EVs miR-378表達(dá)水平升高，其對于RCC 診斷價(jià)值亦明顯優(yōu)于RCC 組織miR-378 測定。本研究結(jié)果顯示，RCC患者組織和血清EVs 中miR-378 變化不一致，但具體分子機(jī)制不清楚。既往報(bào)道顯示，結(jié)腸癌患者miRNA 變化存在類似的現(xiàn)象。結(jié)腸癌患者癌組織中miR-200 家族顯著降低，而分泌的EVs 中miR-200 家族則顯示升高；分子機(jī)制研究顯示，蛋白激酶Cζ（protein kinase Cζ，PKCζ）和ADAR2 調(diào)控軸在癌組織和EVs 中miR-200 家族miRNA表達(dá)變化中發(fā)揮重要作用，癌組織中PKCζ表達(dá)缺失導(dǎo)致ADAR2 磷酸化水平降低，后者可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞miR-200 家族由胞內(nèi)以EVs 形式釋放至胞外，導(dǎo)致結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中miR-200 家族miRNA表達(dá)水平降低，而分泌的EVs 中miRNA水平升高[11]。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測在RCC 組織和細(xì)胞中miR-378 也存在類似的分子調(diào)控機(jī)制，但是否由PKCζ/ADAR2 調(diào)控軸在此過程中發(fā)揮作用仍需后續(xù)深入研究。

本研究對于miR-378 生物學(xué)功能生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-378 靶基因主要與基因轉(zhuǎn)錄、分解代謝、細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)和蛋白激酶活力調(diào)節(jié)等腫瘤調(diào)控通路相關(guān)。研究顯示，miR-378的表達(dá)異常與食管鱗癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演原癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。同時(shí)，大量研究顯示，miR-378 在分解代謝過程中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。KULYTé 等[14]證實(shí)，miR-378可增強(qiáng)腫瘤惡液質(zhì)患者脂解作用。SUN等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-378 可通過調(diào)節(jié)膽汁酸合成影響膽固醇脂代謝。事實(shí)上，分解代謝特別是脂代謝異常又與RCC尤其是腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。因此，推測RCC患者組織中miR-378的異常表達(dá)亦可通過對分解代謝的調(diào)節(jié)參與RCC的發(fā)生發(fā)展。另外，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 生理病理功能尚不清楚。相關(guān)報(bào)道顯示，血清EVs miR-378水平的升高與血管生成、腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，并可作為胃癌的潛在分子標(biāo)志物[18]。NAN 等[19]發(fā)現(xiàn)，脂肪來源干細(xì)胞分泌攜載miR-378的EVs 可有效促進(jìn)血管生成。BRIAND 等[20]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的EVs miR-378 可抑制自然殺傷細(xì)胞（NK）顆粒酶B的分泌，降低NK 細(xì)胞對于腫瘤細(xì)胞殺傷毒性并導(dǎo)致化療情況下腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 也可通過類似的作用機(jī)制發(fā)揮癌相關(guān)生物學(xué)功能參與RCC的發(fā)生發(fā)展。

本研究對于血清EVs miR-378 作為RCC患者輔助診斷標(biāo)志物研究結(jié)果進(jìn)一步表明，EVs miRNA是一類較組織miRNA 更具價(jià)值和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛能的分子標(biāo)志物，具有操作方便快捷、能反復(fù)獲取、易于實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)[21]。但是，EVs miRNA研究仍面臨許多問題。首先，血清EVs分離尚無統(tǒng)一方法。目前應(yīng)用較多的包括經(jīng)典的超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、試劑盒法、免疫法等，不同方法各具優(yōu)劣勢[22]。本研究采用的試劑盒應(yīng)用較為方便，適合單樣本血清水平操作，對于EVs miRNA 臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用較具優(yōu)勢，但分離的EVs 純度可能低于離心法和超濾法。范維肖等[23]通過比較不同EVs分離方法，發(fā)現(xiàn)超離法適合EVs 各方面研究，而膜親和層析法則更適合EVs 核酸研究，這對于后續(xù)EVs miRNA研究具有重要的指導(dǎo)作用。其次，EVs miRNA的測定無合適的內(nèi)參。不同研究對于EVs miRNA的歸一化采用的方法各異，這對于EVs miRNA 臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用和推廣造成了較大挑戰(zhàn)，亦提示EVs miRNA 合適內(nèi)參及歸一化方法仍是未來研究的重要方向。

本研究存在一定的局限性。研究發(fā)現(xiàn)RCC 組織中miR-378的表達(dá)降低，推測其可能與PKCζ/ADAR2 調(diào)控軸作用相關(guān)，但具體分子機(jī)制仍需后續(xù)深入探討。其次，由于RCC miR-378的表達(dá)變化可能與患者臨床分期有關(guān)，但限于本研究樣本納入有限，且組織樣本臨床分期主要集中于早期RCC，是否不同分期樣本RCC miR-378表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異尚不確定。再次，本研究發(fā)現(xiàn)EVs miR-378的表達(dá)上調(diào)，但樣本量相對較少，且來自于同一醫(yī)院，EVs miR-378的RCC 診斷價(jià)值仍需多中心、大樣本量研究證實(shí)。另外，后續(xù)研究中應(yīng)注重同一患者RCC 組織和血清EVs 中miR-378表達(dá)變化研究，對于明確miR-378 臨床價(jià)值具有較為重要意義。

綜上，本研究針對RCC患者血清中變化爭議較大的miR-378，對其在RCC 組織和血清EV 中的表達(dá)變化進(jìn)行檢測和臨床價(jià)值分析，發(fā)現(xiàn)miR-378 在RCC 組織中降低，在血清EVs 中表達(dá)升高，RCC組織和血清EVs 中miR-378水平測定可作為RCC患者輔助診斷分子標(biāo)志物；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明miR-378 可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、分解代謝、細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)和蛋白激酶活力調(diào)節(jié)等腫瘤密切相關(guān)通路參與RCC 發(fā)生發(fā)展，通過對組織、血清EVs miR-378表達(dá)變化分子機(jī)制及功能研究可為RCC 診治提供新的思路和理論依據(jù)。