邢一浩，楊 成，鐵 妍，賈雪珂，徐靜蕾，劉 玲

（河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

原發(fā)性肝癌（肝細(xì)胞癌，hepatic cell carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，在我國，HCC是死亡率僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤［1］。因此，對于HCC的防治，探索新的化學(xué)預(yù)防策略顯得尤為重要。偶氮鎓二醇鹽類衍生物O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧羰基）哌嗪-1-基〕重氮-1-1，2-二醇酯（JS-K）是一種新型的一氧化氮（nitric oxide，NO）供體，它具有NO釋放濃度高、靶向性好等優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，JS-K可通過促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累，激活線粒體凋亡途徑，引起GSE-1細(xì)胞凋亡；通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，引起線粒體膜電位下降，激活胱天蛋白酶3介導(dǎo)的線粒體途徑，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡［2-3］。阿司匹林通過抑制環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）活性干擾前列腺素合成，發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用。研究表明，阿司匹林可通過上調(diào)Bax等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，抑制HepG2細(xì)胞增殖［4］。研究顯示，JS-K和阿司匹林聯(lián)用可顯著上調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3），下調(diào)早期生長應(yīng)答因子1（early growth response protein 1，EGR1），從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖［5］。EGR1主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，而ATF3可負(fù)向調(diào)控EGR1表達(dá)［6-7］。本研究選取了2種肝癌細(xì)胞系（HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞）為研究對象，探討NO供體JS-K聯(lián)用阿司匹林對其凋亡的影響及其機(jī)制，為肝癌提供新的治療策略和研究方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和儀器

人肝癌HepG2和SMMC7721細(xì)胞，由本實驗中心保存。JS-K（美國Santa Cruz公司）；阿司匹林（美國Sigma公司）；Z-VAD-FMK（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基和DAPI（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；MTT（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒（美國BD公司）；兔抗人活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗人β肌動蛋白多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Axio Observer 3倒置熒光顯微鏡（德國蔡司公司）；DYCZ-40D電泳儀（北京六一科技有限公司）；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（上海天能科技有限公司）；BD AccuriC6流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

取對數(shù)生長期HepG2和SMMC7721細(xì)胞，用含10%胎牛血清、青霉素100 IU·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選取JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林5，10，20 mmol·L-1單用或聯(lián)用處理細(xì)胞。將2種細(xì)胞分別隨機(jī)分為細(xì)胞對照組（只加等量終濃度＜0.01%二甲亞砜）、JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1組（同時給藥）。以上分組藥物單獨或聯(lián)用處理細(xì)胞24 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

用0.25%胰酶常規(guī)消化后，將細(xì)胞密度調(diào)整至3×107L-1，每孔200 μL接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后分組給藥同1.2，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔分別加MTT溶液20 μL（5 g·L-1），4 h后棄去上清，每孔中分別加DMSO 150 μL，于黑暗環(huán)境振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度（A490nm）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-藥物組A490nm/細(xì)胞對照組A490nm）×100%。根據(jù)3次實驗的細(xì)胞增殖抑制率使用CalcuSyn軟件計算聯(lián)合用藥指數(shù)（combination index，CI）。CI＞1表示拮抗作用，CI＜1表示協(xié)同作用，CI=1表示相加作用［8-9］。

1.4 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

用0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107L-1，每孔200 μL接種于96孔板，按1.2分組加藥，培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察各個濃度下細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.5 AnnexinV-FlTC/Pl雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

用0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1，每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%后按1.2分組加藥。培養(yǎng)24 h后收集上清和細(xì)胞，于室溫367×g離心5～10 min，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞1次，367×g離心5～10 min，洗滌細(xì)胞，加入300 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加5 μL的AnnexinV-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μL PI染色，并補(bǔ)加200 μL結(jié)合緩沖液。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 DAPl染色檢測細(xì)胞凋亡

將對數(shù)生長期的HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞，用0.25%胰酶常規(guī)消化后，調(diào)整細(xì)胞密度3×107L-1，每孔500 μL接種于48孔板。實驗分為6組：細(xì)胞對照組、Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1組（Z-VAD-FMK 提前1 h加入）。培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%后加藥處理，孵育24 h后，加適量DAPI染色液，在室溫下孵育5 min后，棄DAPI染色液，PBS洗3次，置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.7 Western印跡法檢測活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期的HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3×107L-1，2 mL種于6孔板內(nèi)。按1.6細(xì)胞分組給藥后，置培養(yǎng)箱中孵育24 h后，使用細(xì)胞刮刀收集各組細(xì)胞，367×g離心5 min，然后用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次。加裂解液提取總蛋白，并采用BCA法測定總蛋白含量，調(diào)整各組的蛋白濃度使其一致，然后各組分別加5×上樣緩沖液振蕩均勻，沸水浴5 min使蛋白質(zhì)充分變性，進(jìn)行SDS-PAGE并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在搖床上封閉30 min，加（1∶1000）稀釋的一抗后在4℃過夜。用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，加（1∶3000）稀釋的二抗室溫1 h，之后用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，之后加化學(xué)發(fā)光液掃描圖像。采用Image J軟件對蛋白印跡條帶進(jìn)行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的IA值之比表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 JS-K與阿司匹林聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響

MTT結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對照組比較，JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1組HepG2和SMMC7721細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.01）；與JS-K 5 μmol·L-1組比較，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10和20 mmol·L-1組 HepG2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），兩藥具有協(xié)同效應(yīng)（CI＜1）。

2.2 JS-K與阿司匹林聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察到（圖1），JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林5，10和20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1組 HepG2 和SMMC7721細(xì)胞生長遲緩，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞扁圓，細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中。

2.3 JS-K與阿司匹林聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對照組比較，HepG2和SMMC7721細(xì)胞JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林 10 和 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1組及SMMC-7221細(xì)胞阿司匹林5 mmol·L-1組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與JS-K 5 μmol·L-1組比較，2種細(xì)胞JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1組凋亡率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 JS-K與阿司匹林聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

DAPI染色結(jié)果（圖 3）顯示，JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1組的HepG2和SMMC7721細(xì)胞部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，可見月牙形的典型凋亡特征；JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1組的細(xì)胞中核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，核碎裂等凋亡特征更加明顯。JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1組細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，核碎裂等凋亡特征減少。

2.5 JS-K與阿司匹林聯(lián)用對人肝癌細(xì)胞活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3以及活化PARP蛋白表達(dá)的影響

Western印跡實驗結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對照組比較，JS-K 5 μmol·L-1組、阿司匹林20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1組、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VADFMK 50 μmol·L-1組的HepG2和SMMC7721細(xì)胞活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與JS-K 5 μmol·L-1組或阿司匹林 20 mmol·L-1組比較，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1組細(xì)胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3以及活化PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與 JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1組細(xì)胞比較，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1組細(xì)胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，NO供體JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林5，10和20 mmol·L-1均可顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721的增殖，鏡下可觀察到細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中的數(shù)量增加，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少。其中，JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林20 mmol·L-1聯(lián)合給藥具有較好的協(xié)同作用（CI＜1）。有研究顯示，JS-K作用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系LN229和U87細(xì)胞6 h后，可引起COX-2基因表達(dá)的上調(diào)（U87 17.2倍，LN229 6.7倍）［5］。而阿司匹林可抑制COX活性，在多種腫瘤細(xì)胞中顯示了良好的抑制作用［10-11］。化療藥物也可通過誘導(dǎo)胱天蛋白酶3活化使COX-2表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；COX抑制劑可協(xié)同化療藥物如索拉非尼的抗腫瘤作用［12］。本研究結(jié)果表明，JS-K 5 μmol·L-1與阿司匹林5，10和20 mmol·L-1聯(lián)用后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，如染色質(zhì)濃縮、核碎裂的細(xì)胞不同程度增多，加入胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK后，具有凋亡特征的細(xì)胞相應(yīng)減少，提示兩藥聯(lián)用的作用機(jī)制與細(xì)胞凋亡通路激活有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的過程實際上是胱天蛋白酶被活化并發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)。胱天蛋白酶9屬于啟動型胱天蛋白酶，當(dāng)有其他輔助因子作用時，發(fā)生自我活化，激活下游的胱天蛋白酶。其中胱天蛋白酶3屬于下游執(zhí)行型胱天蛋白酶，能夠特異性裂解底物，促使細(xì)胞凋亡［13］。PARP在應(yīng)激條件下與DNA修復(fù)相關(guān)，在體內(nèi)主要被胱天蛋白酶3剪切而活化，PARP剪切活化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)，也通常被認(rèn)為是胱天蛋白酶3激活的指標(biāo)［14］。本研究結(jié)果表明，JS-K和阿司匹林聯(lián)用能更好促進(jìn)HepG2和SMMC7721 2種肝癌細(xì)胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達(dá)增加，提示JS-K和阿司匹林聯(lián)用后在一定程度上激活了胱天蛋白酶，觸發(fā)了相應(yīng)的胱天蛋白酶凋亡信號通路；加入泛胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK后，活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表達(dá)明顯降低，提示JS-K和阿司匹林聯(lián)用可激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使相應(yīng)活化蛋白表達(dá)增加，從而觸發(fā)凋亡的發(fā)生。

綜上所述，JS-K聯(lián)合阿司匹林對HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞具有顯著抑制作用，通過激活胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3，使胱天蛋白酶3下游底物PARP激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為進(jìn)一步促進(jìn)NO供體和COX抑制劑的聯(lián)用提供了重要的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。