吳卓娜，朱鯤鵬，顧若蘭，孟志云，甘 慧，朱曉霞，李 儉，竇桂芳

（1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；2.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心，天津 300162）

羧肽酶 G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是用基因重組技術從假單胞菌獲得的甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）解毒劑，特異性地作用于MTX游離羧基端的谷氨酸，可快速、持久、大量地將MTX轉化為非活性代謝產物，降低大劑量MTX在臨床腫瘤治療中的風險［1-5］?；A研究和臨床試驗均顯示，CPG2迅速降低體內MTX濃度，不通過生物膜轉運，對進入腫瘤細胞內的MTX的抗腫瘤活性影響較小，安全性良好。目前，美國FDA已批準其作為MTX的解毒藥上市［6-8］。

本研究采用同位素示蹤法對國產的CPG2進行［125I］標記（即［125I］CPG2），并對其在大鼠體內的藥動學、組織分布和排泄進行研究，為臨床研究及臨床用藥提供數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

重組CPG2凍干粉針劑（批號：20110803，每支3.50 mg，活性1500 U），重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司；三氯醋酸（trichloroacetic acid，TCA，批號：20110-919，每瓶500 mL），國藥集團化學試劑有限公司；BCA蛋白分析測定試劑盒（批號：TC263614，每盒10 mg），美國Thermo公司；［125I］CPG2（每瓶1 mL，放射性1mCi），由北京福瑞生物工程公司標記并純化。

高效液相色譜儀（LC-20AT），日本島津公司；γ計數(shù)儀（Wallac 1470），美國PerkinElmerTM公司；高效液相色譜儀自動分步收集器（BS-100A），上海滬西分析儀器廠；酶標儀（EIX800），美國Bio-Tek公司；凝膠色譜柱（TSK-GEL G2000，規(guī)格：300 mm×7.8 mm，5 μm），日本東芝公司。

1.2 動物

Wistar大鼠36只，雌雄各半，體重180～220 g，購自軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（京）2007-004，實驗動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK（軍）2007-004。動物飼養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物福利倫理委員會要求，大鼠自由飲水攝食，在室溫24～26℃、濕度55%～65%、明暗交替12 h（7∶00-19∶00照明）的環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周。

1.3 [125l]CPG2的純度和蛋白含量測定

用高效液相色譜法鑒定［125I］CPG2的純度，洗脫液為 0.01 mol·L-1磷酸緩沖液，pH 7.4，流速1.0 mL·min-1。用分步收集器收集洗脫液，每0.5 min收集1管，用γ計數(shù)儀測定每管的放射性。用BCA試劑盒測定其蛋白含量，96孔板每孔加25 μL系列標準牛血清白蛋白（0.031～2.0 g·L-1）及［125I］CPG2，然后加入200 μL BCA混勻，37℃置30 min，用酶標儀測定其在570 nm處的吸光度值，繪制標準曲線，加權最小二乘法（1/X2）計算［125I］CPG2的蛋白含量。

1.4 [125l]CPG2在大鼠體內藥動學

6只Wistar大鼠，雌雄各半，尾靜脈推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射劑量936.88 kBq·kg-1，飼以標準大鼠飼料，自由飲水。給藥前及給藥后0.08，0.5，1，2，4，14和24 h經眼眶靜脈采血，8000×g離心10 min取血清，加入等體積的20%TCA進行酸沉，然后5000×g離心5 min，棄上清，測定酸沉物的放射性。根據血清中酸沉物放射性計算不同時間點的藥物濃度，再根據藥物濃度-時間曲線，計算[125I]CPG2在大鼠體內的藥動學參數(shù)。

1.5 [125l]CPG2在大鼠體內組織分布

18只Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為3組（0.5，6和24 h組），尾靜脈推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射劑量936.88 kBq·kg-1。分別于推注結束后0.5，6和24 h取全血，并將大鼠安樂死，取肝、腎、脾、肺、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮、輸卵管、輸精管、心臟、胰腺、胸腺、小腸、小腸內容物、脂肪、膀胱、胃、胃內容物、大腸、大腸內容物、骨骼、骨骼肌、皮膚、骨髓、腦和眼球，共28種組織或體液、內容物及全血樣本。組織和內容物分別稱重，剪碎；血液離心，取血清。各處理后的樣本加入等重量的20%TCA沉淀蛋白，5000×g離心5 min，棄上清，測定酸沉物的放射性，并計算同一時間點相同組織的平均放射性。

1.6 糞-尿和膽汁排泄實驗

Wistar大鼠6只，雌雄各半，尾靜脈推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1（放射劑量936.88 kBq·kg-1）后單獨飼養(yǎng)于代謝籠內，飼以標準大鼠飼料，自由飲水。給藥前和給藥后5，8，15，24，41，50，73，102，159，190，211，230和286 h收集尿液和糞便，記錄體積或重量，測定其放射性。

Wistar大鼠6只，雌雄各半，麻醉后行膽管插管手術。待大鼠清醒后，尾靜脈推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射劑量936.88 kBq·kg-1，給藥后5，8，15和24 h收集膽汁，記錄體積，測定其放射性。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用計算機程序Microsoft Excel和Microcal Origin進行數(shù)據處理和制圖。采用WinNorlin 5.2的非房室模型計算藥動學參數(shù)。

2 結果

2.1 [125l]CPG2的純度和蛋白含量

［125I］CPG2經TSK-GEL G2000凝膠過濾色譜分離后得到一個放射性主峰，該主峰在相同條件下與未標記的CPG2的洗脫保留體積一致，表明洗脫出的放射性主峰為［125I］CPG2，且放射性主峰的放射量占總放射量的95.06%。放射性主峰流分用BCA試劑盒測得蛋白濃度為840 mg·L-1，換算得到比活性為13.87 GBq·g-1，放化純度為97.8%，滿足實驗要求。

2.2 [125l]CPG2在大鼠體內的藥動學參數(shù)

大鼠靜脈推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1后平均血藥濃度-時間變化曲線見圖1。藥-時曲線下面積AUC 為（27 792±6896）μg·h·L-1，峰濃度Cmax為（16 894±1809）μg·L-1，清除率CL為（0.026±0.005）L·h-1·kg-1，表觀分布容積Vd為（0.16±0.04）L·kg-1，半衰期t1/2為（4.2±0.6）h。

2.3 [125l]CPG2在大鼠體內組織分布

大鼠靜脈注射［125I］CPG2 700 μg·kg-1后，不同時間點不同組織、內容物及血清的平均放射性見表1。實驗結果顯示，［125I］CPG2主要分布在血清中，其次為血流豐富的組織及代謝和排泄器官，如肝、腎和胃內容物，在腦、肌肉和脂肪中較低，表明藥物不易進入脂肪和肌肉組織，不易透過血腦屏障。給藥24 h后［125I］CPG2在泌尿排泄系統(tǒng)內濃度較高，說明其主要通過腎排泄。

Tab.1 Average radioactivity in different tissues，body fluids and contents of digestive tract at different time points after intravenous injection of［125l］CPG2 in rats

2.4 [125l]CPG2在大鼠體內的排泄

大鼠靜脈注射［125I］CPG2 700 μg·kg-1后286 h內糞便、尿液和膽汁的平均累積排泄量見表2。給藥后286 h內，從尿液中回收到給藥量的（84±4）%，從糞便中回收到給藥量的（3.00±0.78）%，糞尿合計（87±4）%。給藥后24 h內，從膽汁中回收到給藥量的（7.77±0.54）%。

Tab.2 Average cumulative excretion of［125l］CPG2 in feces，urine and bile of rats after intravenous injection of［125l］CPG2

3 討論

本研究應用同位素示蹤法探究了［125I］CPG2在大鼠體內的藥動學、組織分布和排泄的特點。大鼠尾靜脈推注［125I］CPG2后，于不同時間取大鼠組織、內容物及全血，通過γ計數(shù)儀測定TCA可沉淀部分的放射性。TCA可沉淀部分是相對分子質量較大的蛋白質，近似代表原形藥物CPG2，因此用TCA沉淀部分的放射性統(tǒng)計分析各組織、內容物及血清中CPG2的含量。大鼠尾靜脈推注［125I］CPG2后，放射性主要分布在血清中，其次為血流豐富的組織及代謝和排泄的器官，如肝、腎及胃腸道等。［125I］CPG2在腦組織中濃度較低，表明其不易透過血腦屏障；給藥后6和24 h，［125I］CPG2在泌尿排泄系統(tǒng)內的濃度較高，推測CPG2可能通過腎排泄。［125I］CPG2在脂肪、肌肉中的放射性含量較低，表明該蛋白不易進入脂肪、肌肉等組織。［125I］CPG2在胃內容物中濃度比較高，可能與標記方法有關。［125I］需要標記到CPG2的酪氨酸上，酪氨酸是堿性氨基酸，胃液為酸性環(huán)境，代謝后的125I-酪氨酸或蛋白片斷可能通過胃壁分泌，導致在胃腸道內有較高的放射性分布。［125I］CPG2在大鼠體內的排泄研究表明，藥物主要從尿液中排泄，少量從糞便中排泄，70%的放射性在給藥后24 h內已經排泄，給藥后41～286 h的排泄較緩慢，286 h時排泄≥80%。糞便和尿液中的放射性主要是［125I］CPG2的降解產物。

本研究結果可為制定CPG2的臨床給藥方案提供參考依據，同時也可為其他藥物的藥動學及組織分布和排泄研究提供借鑒。