朱艷慧，劉雅琳，祝俠麗，蔡邦榮，賈永艷

（河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046）

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的傳染病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。流感病毒可借助空氣迅速傳播，引起呼吸道感染，免疫缺陷患者感染易患嚴重的并發(fā)癥，如肺炎或急性呼吸衰竭等［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2019年報道，全球每年估計有10億流感病例，其中300萬～500萬重癥病例，29萬～65萬死亡病例［2］。接種疫苗是減輕流感流行的有效手段，但兒童、老年人、慢性呼吸道疾病患者和孕婦等易感人群易出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，需及時使用抗病毒藥物治療降低該風險。另外，疫苗研發(fā)具有滯后性，有效的抗病毒藥物治療可延遲或阻斷病毒傳播［3］。目前，直接靶向流感病毒蛋白或基因及靶向參與病毒復制和傳播的關(guān)鍵宿主因子是抗流感病毒藥物研發(fā)的有效策略［4］。

流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）家族，是分節(jié)段單鏈反義RNA病毒。根據(jù)病毒基質(zhì)蛋白1（matrix 1，M1）和核蛋白的抗原性，可將流感病毒分為甲型（influenza A virus，IAV）、乙型（influenza B virus，IBV）、丙型（influenza C virus，ICV）和丁型（influenza D virus，IDV）。IAV根據(jù)其表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的分子特征又可分為不同亞型，迄今鑒定的有18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）［5］。IAV可感染人、動物和禽類等多種物種，易受到抗原變異的影響?？乖儺惻c表面蛋白HA和NA的變化有關(guān)，通常被歸類為抗原漂移（antigenic drift）或抗原轉(zhuǎn)變（antigenic shift）?？乖瓢℉A或NA蛋白的小的、漸進的氨基酸取代，這可能導致流感小規(guī)模暴發(fā)。當HA或NA蛋白發(fā)生顯著變化時，抗原轉(zhuǎn)變就會產(chǎn)生新的流感病毒亞型，有可能引起流感大規(guī)模流行；而每個流感病毒亞型都同時編碼HA和NA蛋白（如H3N2和H5N1）［6］。

圖1為流感病毒依靠宿主細胞進行復制涉及的多個步驟［7］。HA與細胞表面的唾液酸（sialic acid，SA）受體結(jié)合后，病毒顆粒被內(nèi)吞進入細胞，形成內(nèi)吞體。此時，離子通道蛋白M2被激活，離子通道打開，允許H+進入病毒；pH值降低到5.0時，內(nèi)吞體膜與病毒包膜融合，病毒粒子中的病毒RNA（viral RNA，vRNA）被釋放到細胞質(zhì)中（脫殼）。vRNA與RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）被輸運到細胞核進行轉(zhuǎn)錄和復制。合成的RNA不含mRNA所必需的帽子（Cap）結(jié)構(gòu)，RdRp的Cap依賴性內(nèi)切酶將宿主mRNA的Cap結(jié)構(gòu)切除并轉(zhuǎn)移到vRNA上，形成病毒mRNA（搶帽反應(yīng)）。vRNA被轉(zhuǎn)錄成mRNA，用于產(chǎn)生病毒蛋白，并通過互補RNA（complementary RNA，cRNA）進行復制。病毒蛋白和RdRp-RNA復合體形成病毒顆粒，隨后從細胞膜上出芽。從細胞表面生長出來的病毒顆粒上的HA與被感染細胞表面的SA受體結(jié)合，NA通過水解SA受體釋放出病毒顆粒，成為具有感染力的新病毒。

截至2020年，美國和日本已批準用于臨床治療的主要抗流感病毒藥物見表1。其中，美國疾病控制與預防中心（CentersforDiseaseControland Prevention）推薦奧司他韋（oseltamivir，Tamiflu）、扎那米韋（zanamivir，Relenza）、帕拉米韋（peramivir，Rapivab）和巴洛沙韋（baloxavir marboxil，S-033188，Xofluza）用于治療急性無并發(fā)癥的非妊娠期門診流感患者［8］；拉尼米韋（laninamivir，Inavir）和法匹拉韋（favipravir，T-705，Avigan）在日本被批準作為抗流感藥物［9-10］。

表1 截至2020年已批準用于臨床治療的主要抗流感病毒藥物

目前，正處于非臨床和臨床研究階段的抗流感病毒藥物主要包括HA抑制劑、M2離子通道蛋白抑制劑、RdRp抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑等。本文綜述抗流感病毒藥物的抗病毒活性、作用機制和臨床應(yīng)用的研究進展，以期為研發(fā)具有廣譜活性的新型抗流感病毒藥物提供參考。

1 靶向血凝素的抗流感病毒藥物

流感病毒HA不但介導與SA受體的結(jié)合，還參與病毒包膜與內(nèi)吞體膜的融合。HA分子作為同源三聚體聚集在病毒粒子表面形成外部尖峰，具有高度的α螺旋二級結(jié)構(gòu)，處于亞穩(wěn)態(tài)，疏水融合肽隱藏在分子的底部［11］。HA蛋白形成膜遠端口袋作為結(jié)合位點，構(gòu)成袋子的氨基酸殘基通過氫鍵和范德華力與宿主細胞膜上SA受體相互作用進入細胞內(nèi)。HA1（重鏈）是宿主細胞受體結(jié)合的關(guān)鍵位點；而HA2（輕鏈）是體內(nèi)融合的關(guān)鍵位點［12］。在內(nèi)吞體低pH環(huán)境下，HA發(fā)生構(gòu)象變化，HA前體（HA0）經(jīng)剪切后形成HA1和HA2，將埋藏的HA2融合肽擠壓到HA分子的遠端。新形成的HA2 N端融合肽插入內(nèi)吞體膜導致兩膜合并，形成明顯的半融合中間體，然后形成融合孔，病毒核糖核蛋白復合體從內(nèi)吞體通過融合孔釋放到細胞質(zhì)中［13］。

目前，抑制HA與SA受體的結(jié)合阻斷病毒感染是抗流感病毒藥物研發(fā)的重要策略。根據(jù)其靶標不同，抑制病毒吸附的抗流感病毒藥物可分為4類（表2）。

表2 靶向血凝素（HA）的抗流感病毒藥物

1.1 血凝素前體糖基化抑制劑

HA0的頭區(qū)在幾個位置有大量糖基化。HA的糖基化與受體結(jié)合特異性、毒力、傳導性和抗體免疫應(yīng)答有關(guān)。硝唑尼特（nitazoxanide）是噻唑內(nèi)酯類抗感染藥物，用于治療兒童和成人隱孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲引起的腸炎，其活性循環(huán)代謝物替唑尼特（tizoxanide）對多種流感病毒株均具有抗病毒活性［14］。硝唑尼特可通過阻斷HA末端糖基化和損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的HA0轉(zhuǎn)運對H1N1具有抗病毒活性。噻唑內(nèi)酯類在翻譯后水平通過選擇性阻斷HA在抗糖苷內(nèi)切酶H消化之前階段的成熟，從而損害HA細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及插入宿主細胞膜，這是病毒正確組裝和從宿主細胞釋放的關(guān)鍵步驟。目前，硝唑尼特在美國已完成治療≥12歲無并發(fā)癥流感患者的Ⅲ期臨床試驗（NCT03336619）［15］。衣霉素（tunicamycin）是一種核苷類抗生素，具有N-糖基化抑制作用，具有廣譜抗病毒作用，但細胞毒性限制了其應(yīng)用；而IW3和IW7（2-脫氧尿苷衍生物）靶向病毒糖蛋白成熟過程中的多糖加工步驟，對IAV復制有較強的抑制作用［16］。

1.2 血凝素前體裂解抑制劑

蛋白酶將HA0裂解為HA1和HA2是病毒融合的第一步。在體外實驗中，需要將胰蛋白酶添加到細胞培養(yǎng)基中，促進流感病毒感染。因此，蛋白酶抑制劑是一種有效的抗病毒策略。抑肽酶能抑制引起流感病毒激活的絲氨酸蛋白酶，俄羅斯已批準抑肽酶作為抗流感藥物，霧化吸入用于治療輕度到中度流感；靜脈滴注用于治療嚴重流感減少全身病理學和炎癥反應(yīng)［17］。絲氨酸蛋白酶抑制劑亮抑蛋白酶肽（leupeptin）［18］和卡莫司他（camostat）［19］均可抑制HA0裂解，并通過作用于HA裂解位點上的單一精氨酸限制人類和禽流感病毒的繁殖。最近，卡莫司他又被用于治療新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）［20］。6-氨基己酸在兒童患者中可縮短流感病毒抗原在鼻咽上皮中的持續(xù)時間，并將流感癥狀的持續(xù)時間縮短至原時間的2/3～1/2，其吸入給藥可發(fā)揮最有效的抗病毒作用和治療效果［21］。但選擇一種蛋白酶抑制劑只特異性地作用于HA的裂解而不影響其他細胞蛋白酶，這是需要解決的一項難題。

1.3 血凝素吸附抑制劑

流感病毒通過HA與宿主細胞表面含SA低聚糖的糖蛋白和糖脂結(jié)合而引起感染，可通過去除SA受體或保護SA受體2個途徑阻止病毒吸附，阻止其與HA結(jié)合。DAS181（流感酶）是一種46 ku的重組蛋白，由細菌SA酶催化域和黏膜細胞表面錨定序列組成，可切斷分別表達在人上呼吸道和下呼吸道的SA α-2，6半乳糖受體和α-2，3半乳糖受體與宿主細胞表面的連接。在一項評估DAS181對季節(jié)性和大流行流感病毒感染療效的完整Ⅱ期臨床試驗中，DAS181以每天10 mg·kg-1的吸入劑量連續(xù)給藥5 d，可顯著降低流感病毒滴度［22］。

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1.4 血凝素膜融合抑制劑

HA作為一種病毒包膜蛋白，在病毒遺傳物質(zhì)進入感染細胞的細胞質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用。通過改變pH環(huán)境，阻止HA構(gòu)象變化干預膜融合過程。MBX2546是一種（H1和H5亞型）IAV抑制劑，通過直接結(jié)合HA蛋白的莖區(qū)，靶向HA介導的病毒宿主膜融合。由于MBX2546與HA蛋白穩(wěn)定結(jié)合，阻止了pH改變誘導融合所需的構(gòu)象變化［23］。BMY-27709含有水楊酸酰胺骨架結(jié)構(gòu)，可作為“分子膠”來抑制HA2融合肽的移動，阻斷HA介導的融合過程，在感染早期發(fā)揮抗流感病毒作用，并且只對H1和H2亞型病毒有效，對H3亞型病毒無效［24］。阿比多爾（umifenovir，Arbidol）是一種廣譜抗病毒藥物，可抑制多種包膜和非包膜病毒，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇B5、副流感病毒、埃博拉病毒以及乙型和丙型肝炎。阿比多爾結(jié)合在HA三聚體莖區(qū)的疏水腔中，通過分子膠作用穩(wěn)定HA的預融合構(gòu)象，在內(nèi)吞體的低pH值環(huán)境中抑制與膜融合相關(guān)的構(gòu)象重排，可用于治療由IAV和IBV引起的上呼吸道感染。在俄羅斯和中國，阿比多爾主要作為非處方藥物用于預防和治療包括流感在內(nèi)的急性呼吸道感染［25］。目前，在中日友好醫(yī)院正在進行阿比多爾與奧司他韋聯(lián)合用藥治療≥16歲嚴重流感患者的Ⅲ期臨床試驗（NCT03787459）［26］。但阿比多爾主要缺點是必須使用大劑量才能達到血漿濃度峰值和治療效果，臨床使用較少。另外，苯并醌類和對苯二酚類化合物可抑制低pH誘導的HA構(gòu)象變化。這些化合物還可抑制病毒誘導的合胞體形成、HA介導的溶血和體外病毒感染。作用最強的叔丁基對苯二酚抑制H3N2病毒HA的構(gòu)象變化，抑制體外培養(yǎng)細胞病毒感染的IC50值為5～10 μmol·L-1［27］。司他弗林（stachyflin）類化合物、羅漢松酸類衍生物和六氫吡啶類衍生物均可通過抑制低pH誘導的HA構(gòu)象變化發(fā)揮抗流感病毒活性［28］，但當流感病毒HA糖基化缺失或減少時此類藥物的抗流感活性會降低。

2 靶向離子通道蛋白M2的抗流感病毒藥物

IAV和IBV含有不同的包膜蛋白，分別是AM2和BM2，發(fā)揮質(zhì)子通道作用。流感病毒通過內(nèi)吞作用進入感染的細胞后，包含在內(nèi)吞體中的病毒粒子必須酸化才能脫殼將遺傳物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)中。AM2和BM2是同源四聚體組成的Ⅲ型跨膜蛋白，由N端胞外區(qū)、單跨膜區(qū)和C端胞內(nèi)尾區(qū)組成。AM2和BM2除跨內(nèi)膜區(qū)殘基HXXXW有相同之處，其他一級序列差異較大［29］。M2跨膜區(qū)的四聚體形成門控離子通道，當胞外區(qū)暴露于酸性環(huán)境時通道打開，選擇性透過質(zhì)子進入病毒顆粒內(nèi)。病毒內(nèi)pH降低促進病毒包膜與內(nèi)吞體膜的融合，病毒核糖核蛋白復合體與M1解離然后進入宿主細胞核進行轉(zhuǎn)錄和復制。由于M2離子通道不僅可在病毒進入細胞后平衡病毒內(nèi)pH，而且在病毒成熟期間平衡高爾基體膜pH，因此M2離子通道可作為有效的抗流感病毒靶標［30］。M2離子通道抑制劑可通過破壞螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性阻斷質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運，發(fā)揮藥理學活性，主要有金剛烷胺和金剛乙胺及非金剛烷胺衍生物。

2.1 金剛烷胺和金剛乙胺

金剛烷胺是1966年批準用于治療IAV感染的第一個抗病毒化合物，其通過M2蛋白通道阻斷H+轉(zhuǎn)運進入病毒顆粒內(nèi)部，從而防止病毒顆粒脫殼。金剛烷胺被發(fā)現(xiàn)后，金剛乙胺及金剛烷胺衍生物被合成［31］。但只有金剛烷胺和金剛乙胺獲準用于成人患者，它們對兒童和老年人IAV感染的預防、治療或縮短病程無效。金剛烷胺和金剛乙胺可抑制AM2離子通道而不抑制BM2，所以兩者只能抑制IAV而不抑制IBV。近年來，金剛烷胺很少使用，因為M2蛋白中第31位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚瑢е缕湓诩仔?H1N1毒株〔A（H1N1）〕pdm09和A（H3N2）中普遍存在耐藥性［32］。

2.2 非金剛烷胺衍生物

多胺類化合物如精胺、亞精胺和腐胺通常被認為是鉀離子通道的內(nèi)在整流器，并與通道孔襯里和側(cè)面的酸性氨基酸殘基相互作用。與金剛烷胺的結(jié)合位點不同，M2蛋白也具有多胺的結(jié)合位點，該位點通常被Na+掩蔽，可作為選擇性抗病毒抑制劑靶點［33］。螺哌啶類及其衍生物對金剛烷胺耐藥病毒株具有抗病毒活性，以螺哌啶-9作用最為顯著。天然產(chǎn)物中，蒎那胺（pinanamine）衍生物和阿魏酸乙酯（24-E-ferulate）具有良好的抗流感活性［6］。

3 靶向RNA依賴性RNA聚合酶的抗流感病毒藥物

流感病毒的轉(zhuǎn)錄和復制是由RdRp復合物催化完成的。流感病毒RdRp復合物是一種由酸性聚合酶（polymerase acidic protein，PA）、堿性聚合酶1（polymerase basic protein 1，PB1）和PB2 3個亞基組成的異源三聚體，以vRNA為模板，在轉(zhuǎn)錄過程中合成含有Cap、多聚腺苷酸化的mRNA，在復制過程中合成cRNA和vRNA［34］。PB1亞基與流感病毒vRNA和cRNA以不同的模式結(jié)合，執(zhí)行RNA聚合酶功能；PB2亞基結(jié)合宿主細胞前體mRNA（pre-mRNA）的5′Cap結(jié)構(gòu)；PA亞基具有內(nèi)切酶活性，剪切宿主細胞前體mRNA的5′Cap結(jié)構(gòu)用于病毒自身mRNA轉(zhuǎn)錄；最后形成具有5′甲基化Cap結(jié)構(gòu)和3′poly（A）尾結(jié)構(gòu)的流感病毒mRNA［35］。流感病毒基因組vRNA轉(zhuǎn)錄過程及潛在的抗流感病毒藥物見圖2和表3。

表3 靶向RNA依賴性RNA聚合酶的主要抗流感病毒藥物

3.1 巴洛沙韋

巴洛沙韋由日本研發(fā)，于2018年2月23日獲得批準，用于治療感染IAV和IBV（年齡≥12歲患者和體重≥10 kg但年齡＜12歲兒童患者）；并于2018年10月24日在美國獲得批準，2019年在其他幾個國家獲得批準，用于治療癥狀出現(xiàn)時間＜48 h、年齡≥12歲且體重≥40 kg的急性無并發(fā)癥的流感患者。目前，在中國已完成一項Ⅰ期單中心、單次口服巴洛沙韋（40或80 mg）在健康受試者體內(nèi)的藥動學、安全性和耐受性評價（NCT03959332）［36］。

巴洛韋酸（baloxavir acid，S-033447），是巴洛沙韋的活性形式，是基于多替拉韋（dolutegravir）的2個金屬藥效團概念經(jīng)合理分子設(shè)計產(chǎn)生的。多替拉韋是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）整合酶的抑制劑，因為流感PA和HIV整合酶都是使用2個二價金屬離子作為輔助因子發(fā)揮內(nèi)切酶活性。為增強巴洛韋酸的口服吸收，添加酚羥基，制備巴洛沙韋。巴洛沙韋可被腸道、肝和血液中的酯酶快速水解為巴洛韋酸［37］。巴洛韋酸結(jié)合到PA內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，并抑制PA對RNA的切割。巴洛韋酸與IAV的A20，Y24，K34，A37和I38或與IBV的T20，F(xiàn)24，M34，N37和I38在PA內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域形成范德華作用。巴洛沙韋的主要優(yōu)點是只需1次給藥，增加了依從性。以減輕癥狀的時間來衡量，巴洛沙韋似乎比奧司他韋無明顯的臨床優(yōu)勢，但其在治療后24 h內(nèi)減少病毒載量的能力使其在預防病毒傳播方面更有優(yōu)勢。在嚴重并發(fā)癥流感病例中，快速減少病毒載量可能會減輕病毒導致的炎癥和對肺組織的損害，從而產(chǎn)生更好的臨床效果［38］。Koshimichi等［39］報道，不論流感高危并發(fā)癥患者或其他流感患者的暴露水平如何，給予巴洛沙韋（體重＜80 kg患者40 mg和體重≥80 kg患者80 mg），均可縮短流感癥狀時間，降低IAV和IBV病毒滴度。

3.2 AL-794

AL-794（ALS-033794/JNJ-64155806）是一種口服有活性的ALS-033719的異丁酸酯前藥，選擇性地結(jié)合于PA內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，有效抑制內(nèi)切酶活性。ALS-033719對29株IAV和IBV均有抑制作用，90%有效濃度（EC90）為2.3～267 nmol·L-1。對健康成人單次或多次遞增劑量給予AL-794，評價其安全性及藥動學。結(jié)果表明，ALS-033719的血漿濃度按遞增劑量比例增加，最高可達150 mg，但＞150 mg時則不按比例增加；AL-794 200 mg，每天2次，可達到ALS-033719暴露劑量，預期有效且普遍耐受［40］。在一項Ⅰ期臨床研究中，健康受試者經(jīng)鼻接種A/Perth/16/2009 H3N2，12 h后poAL-794 50或150 mg，每天2次，連續(xù)給藥5 d。結(jié)果顯示，AL-794具有明顯抗病毒活性，150 mg劑量組病毒載量、癥狀和黏液重量與50 mg劑量組相比明顯降低，且無安全問題［41］?；颊呖赡褪蹵L-974，無嚴重不良事件，最常見的不良反應(yīng)為輕度頭痛和頭痛。2017年5月完成了在健康志愿者中AL-794與奧司他韋和匹莫迪韋（pimodivir，JNJ63623872，VX-787）藥動學相互作用的Ⅰ期臨床評估（NCT02888327）［42］。但2018年4月在健康志愿者中評估其重復給藥方案的安全性、耐受性和藥動學的臨床研究被終止（NCT03411421）［43］。

3.3 法匹拉韋

法匹拉韋是一種取代吡嗪化合物，在細胞中磷酸化代謝成其活性形式法匹拉韋-核呋喃糖基-5′-三磷酸（ribofuranosyl-5′-triphosphate，RTP）。法匹拉韋-RTP以濃度依賴和GTP競爭的方式抑制流感病毒RNA聚合酶活性［44］。法匹拉韋被RdRp識別為嘌呤類似物，并作為鳥苷和腺苷模擬物有效地合并到新生RNA鏈中，阻止GTP和ATP競爭性結(jié)合，并抑制RNA延伸，阻止病毒復制和轉(zhuǎn)錄。此外，法匹拉韋通過增加G→A和C→U突變頻率，導致致命的突變，產(chǎn)生不可存活的子代病毒［45］。因此，法匹拉韋具有新生RNA鏈終止劑或誘變劑的作用，對RNA病毒（包括流感病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒）具有廣譜抗病毒活性，但對DNA病毒無效。法匹拉韋治療流感比奧司他韋有更好的療效［46］，其在治療致病性禽流感H5N1和對奧司他韋耐藥病毒方面的療效也已通過動物實驗得到驗證［47］。2014年，法匹拉韋在日本被批準用于治療新型或再次流行的流感病毒，由于其潛在的不良反應(yīng)，由政府指導用藥，且被其作為儲備藥物用于應(yīng)對嚴重流感治療［11］。在日本，除流感外，法匹拉韋已被提交用于重癥發(fā)熱伴血小板減少綜合征的附加適應(yīng)證［48］。法匹拉韋與奧司他韋聯(lián)合治療嚴重流感患者的臨床試驗結(jié)果顯示，奧司他韋75 mg，每天2次，連續(xù)給藥10 d；法匹拉韋第1天給藥1600 mg，第2～10天600 mg，均每天2次；與奧司他韋單藥治療相比，兩者聯(lián)合治療可促進嚴重流感患者臨床康復［49］。在病毒復制期間停止用藥或出現(xiàn)耐藥株時，病毒復制和發(fā)熱將復發(fā)。由于季節(jié)性流感病毒的復制周期為6 d或更長，因此嚴重流感或新型流感治療可能需要連續(xù)給藥 10 d［50］。

3.4 利巴韋林

利巴韋林（ribavirin，Virazole）合成于1970年，在紅細胞中磷酸化，生成三氮唑核苷單磷酸、二磷酸及三磷酸，具有廣譜抗DNA和RNA病毒活性，包括IAV、IBV、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒和仙臺病毒等［51-52］。利巴韋林可通過抑制肌苷單磷酸脫氫 酶（inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）降低細胞內(nèi)GTP，抑制mRNA 5′Cap形成，以及通過其與腺苷或鳥苷的相似性增加RNA復制中的突變，發(fā)揮抗病毒作用［53］。單磷酸利巴韋林抑制細胞內(nèi)IMPDH；三磷酸利巴韋林（ribavirin 5′-triphosphate，RBV-TP）選擇性抑制流感病毒的RNA聚合酶。利巴韋林被批準用于治療呼吸道合胞病毒，并與干擾素或聚干擾素聯(lián)合用于治療丙型肝炎病毒。盡管利巴韋林潛在的致畸不良反應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用，但其成功應(yīng)用于流感的治療，且未表現(xiàn)出耐藥性的跡象［54］。利巴韋林衍生物LY217896（1，3，4-thiadiazol-2-ylcyanamide）及其鈉鹽在體內(nèi)外均能抗IAV和IBV。塔利韋林（viramidine）是利巴韋林的3-羧脒衍生物，抗病毒療效與利巴韋林相似，但毒性較小，未來有可能用于抗流感治療［55］。在一項比較奧司他韋、金剛烷胺和利巴韋林聯(lián)合給藥與奧司他韋單藥治療的隨機、雙盲、多中心Ⅱ期臨床試驗中，奧司他韋（75 mg）、金剛烷胺（100 mg）和利巴韋林（600 mg）聯(lián)合給藥或奧司他韋單藥治療，每天2次，連續(xù)5 d，并對患者進行28 d的隨訪。結(jié)果顯示，與單藥治療相比，聯(lián)合用藥雖在第3天顯著降低病毒復制，但該差異與改善的臨床受益無關(guān)［56］。

法匹拉韋和利巴韋林均為嘌呤偽堿，但它們對流感病毒的抗病毒和致突變的作用機制卻不同。利巴韋林抗流感病毒作用是基于抑制IMPDH導致GTP快速消耗和核苷酸池的不平衡，而法匹拉韋被病毒聚合酶識別作為GTP競爭抑制劑阻止病毒復制和轉(zhuǎn)錄。在被病毒感染的細胞內(nèi)，法匹拉韋或利巴韋林≥50 μmol·L-1時病毒RNA合成被完全抑制；而暴露在低藥物濃度時則誘導非傳染性病毒顆粒的形成以及病毒基因組中隨機點突變的累積；法匹拉韋的誘變效應(yīng)是利巴韋林的2倍［55］。RBV-TP直接靶向病毒基因組，被病毒聚合酶作為底物摻入到延長的RNA鏈中，導致多個堿基不匹配，從而導致致命突變［57］。而法匹拉韋-RTP被病毒聚合酶識別作為替代底物，使其不能識別GTP和ATP。單個法匹拉韋-核呋喃糖基-5′-單磷酸與vRNA的結(jié)合減慢但未停止vRNA的延伸，連續(xù)2個法匹拉韋-核呋喃糖基-5′-單磷酸的結(jié)合事件可阻止vRNA的進一步延伸［58］。

3.5 匹莫迪韋

匹莫迪韋是一種環(huán)己基羧酸類似物，在“搶帽反應(yīng)”中，PB2結(jié)合到宿主mRNA的m7G Cap結(jié)構(gòu)上。匹莫迪韋占據(jù)PB2的Cap結(jié)合區(qū)域，抑制RNA結(jié)合。匹莫迪韋與PB2 Cap結(jié)合區(qū)域的E361和K376形成氫鍵，其氮雜吲哚環(huán)夾在H357和F404之間，而嘧啶環(huán)與F323相互作用。匹莫迪韋的羧酸通過水介導與R355，H357和Q406相互作用［59］。匹莫迪韋可抑制IAV，包括對M2離子通道抑制劑耐藥和NA抑制劑（NA inhibitor，NAI）耐藥的病毒，但對IBV無效。這可能是由于IAV和IBV的PB2 Cap結(jié)合結(jié)構(gòu)域的幾個關(guān)鍵氨基酸存在差異，IBV Cap結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一些殘基可對匹莫迪韋產(chǎn)生空間阻礙［60］。此外，IBV的Cap結(jié)合親和力和特異性與IAV不同，IBV Cap結(jié)合親和力弱于IAV；IAV對m7G Cap結(jié)構(gòu)有嚴格的特異性，而IBV識別未甲基化Cap結(jié)構(gòu)［61］。對感染IAV住院的老年患者（65～85歲）和非老年患者（18～64歲）進行匹莫迪韋聯(lián)合奧司他韋的Ⅱb期臨床研究，住院患者被隨機分為匹莫迪韋600 mg和奧司他韋75 mg組，每天服藥2次，連續(xù)7 d。結(jié)果顯示，匹莫迪韋在老年和非老年患者中的藥動學參數(shù)相似；匹莫迪韋緩解流感癥狀的時間（72.45 h）比安慰劑的時間（94.15 h）短；與安慰劑組（15.6%）相比，匹莫迪韋組流感相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率（7.9%）較低；治療耐受性一般良好［62］。

4 靶向神經(jīng)氨酸酶的抗流感病毒藥物

NA是同源四聚體Ⅱ型糖蛋白，嵌于流感病毒包膜表面，每個單體亞基折疊成4個不同的結(jié)構(gòu)域：胞漿尾部、跨膜區(qū)、莖狀區(qū)和催化頭區(qū)域。在所有IAV中，胞漿尾部的序列幾乎100%保守，在NA轉(zhuǎn)運和合并過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［63］。但N端疏水跨膜結(jié)構(gòu)域包含1個跨越殘基（7～29的可變氨基酸序列），并提供轉(zhuǎn)位到頂膜和脂質(zhì)筏結(jié)合的信號。不同NA亞型的莖部結(jié)構(gòu)域在氨基酸殘基的數(shù)量和序列上有相當大的差異，影響NA酶活性和毒力。催化頭區(qū)域具有從附近膜糖蛋白上裂解SA的能力，以防止病毒結(jié)合［64］。NA在流感感染過程中具有多個功能：①NA具有SA酶活性，裂解細胞表面SA，釋放新形成的子代病毒顆粒，使其繼續(xù)感染宿主細胞并傳播感染。②NA對病毒在呼吸道黏液中的移動非常重要，可水解呼吸道中的SA，使呼吸道黏膜表面黏液降低，病毒更易感染底層上皮細胞［65］。③NA在病毒粒子進入宿主細胞過程中也發(fā)揮重要作用。首先，NA除擁有與SA及其類似物結(jié)合的催化位點外，還有第2個受體結(jié)合位點，可能在直接受體結(jié)合中發(fā)揮作用，與HA的受體結(jié)合功能互補；其次，NA可能有助于釋放與唾液化“誘餌”受體結(jié)合的病毒粒子，促進病毒在細胞表面移動，從而使HA能夠與受體表達的SA接觸，進而發(fā)生內(nèi)吞作用［66］。

早在1948年就提出了NAI的概念，NAI抑制病毒NA，導致病毒復制和傳播受阻。目前為止，已上市NAI包括奧司他韋、扎那米韋、拉尼米韋和帕拉米韋。除拉尼米韋只在日本獲得許可外，其他3種在世界范圍內(nèi)獲得了治療和預防流感感染的許可［14］。拉尼米韋是一次性吸入給藥，因此可能具有較高的依從性，然而兒童，特別是＜3歲的兒童，吸入給藥可能有困難［67］。帕拉米韋應(yīng)靜脈滴注＞15 min，通常用于治療住院流感患者。奧司他韋和扎那米韋的用藥時間比拉尼米韋和帕拉米韋更長，患者需連續(xù)給藥5 d，且不能過早或當患者開始感覺好轉(zhuǎn)時立即停止用藥。Tochino等［68］在日本大阪進行了一項為期8年的調(diào)查，評價4種NAI對流感的治療效果，結(jié)果顯示，拉尼米韋最常用于年齡≥10歲的患者，而奧司他韋最常用于年齡＜10歲的患者；使用4種NAI具有類似作用，IAV患者均比IBV患者退熱早，年齡較大患者更易發(fā)生低熱（＜38℃）。

IAV具有高度的遺傳變異性，其通過突變逃避宿主免疫反應(yīng)，有時1個點突變就能產(chǎn)生對某些抗病毒藥物的耐藥性，且這種突變每時每刻都在發(fā)生。因此，需要持續(xù)監(jiān)測和評估耐藥病毒株的病毒適應(yīng)度和傳播能力。Lee等［69］報道，對于季節(jié)性流感病毒，NAI耐藥率報道較少（奧司他韋＜3.5%，扎那米韋＜1.0%）；在幼兒（＜5歲）、免疫功能低下者和預防給藥個人中，IAV（H1N1）病毒的耐藥性風險略高于IAV（H3N2）和IBV。H275Y IAV（H1N1）突變株顯示出高水平奧司他韋耐藥，能夠引起流感暴發(fā)；而且NAI對R294K IAV（H7N9）突變株抑制作用減弱。Mawatari等［70］評價4種NAI對 IAV（H1N1 pdm09和H3N2）和IBV的臨床有效性。結(jié)果顯示，拉尼米韋治療表現(xiàn)出較長的發(fā)熱持續(xù)時間；感染H275Y IAV（H1N1）pdm09突變株的兒童患者接受奧司他韋治療，發(fā)熱持續(xù)時間延長。

WHO流感參考和研究合作中心在2014年5月-2015年5月期間檢測了WHO認可的國家流感中心收集的13 312種病毒，以確定4種NAI的50%抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示，約有0.5%的病毒對4種NAI中至少一種表現(xiàn)出高度降低抑制（highly reduced inhibition，HRI）（n=68）或降低抑制（reduced inhibition，RI）（n=56）。在12種HRI病毒中，6種為 IAV（H1N1）pdm09病毒，3種為 IAV（H3N2）病毒，3種為IBV/Yamagata-lineage病毒。對NAI具有RI或HRI的病毒的發(fā)生率低于2013-2014年觀察到的1.9%，但與2012-2013年期間的0.6%相似。根據(jù)目前的分析，雖然出現(xiàn)了一些耐藥病毒株，但NAI仍然是治療和預防流感病毒感染的有效選擇［71］。

5 結(jié)語

流感的防治仍然是一個挑戰(zhàn)。NAI和聚合酶抑制劑等抗病毒藥物雖然為治療流感患者提供了選擇，但均有局限性。由于IAV M2蛋白中氨基酸位點的突變，導致金剛烷胺存在耐藥性，且臨床安全性不佳，需關(guān)注胃腸道不良事件和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，已不被用于治療流感。NAI是最常用的抗流感處方藥物，可縮短流感病程，減輕流感相關(guān)并發(fā)癥，降低死亡率。但流感病毒可通過在NA催化位點或HA受體結(jié)合位點獲得突變而產(chǎn)生對NAI的耐藥性，并且耐藥率在全球逐漸增加，出現(xiàn)了NAI耐藥病毒株的季節(jié)性暴發(fā)。NAI耐藥性主要出現(xiàn)在長時間藥物接觸或亞治療劑量藥物治療后，特別是兒童、免疫缺陷患者和預防服藥者。在危重患者和需要住院治療的重癥患者中，即使早期使用了NAI，流感導致的發(fā)病率和死亡率仍然很高。RdRp對流感病毒轉(zhuǎn)錄、蛋白合成以及基因組復制等病毒復制周期至關(guān)重要，而且參與RNA結(jié)合、裂解和延伸作用的聚合酶活性位點保守，因此聚合酶抑制劑不易產(chǎn)生耐藥性。法匹拉韋和巴洛沙韋可用于對金剛烷胺和NAI具有耐藥性的病毒株。法匹拉韋作為廣譜抗病毒藥物已在我國上市，巴洛沙韋尚處于新藥上市審評階段。另外，將抗病毒藥物與其他免疫調(diào)節(jié)藥物如大環(huán)內(nèi)酯、N-乙酰半胱氨酸、他汀類藥物、非甾體抗炎藥物和類固醇等聯(lián)用，可能是治療流感重癥患者的有效策略之一。