王 慧，蘭小兵，鄭 萍，王 晴，馬 琳，楊佳美，劉 寧，3，余建強(qiáng)，3

〔1.蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心），江蘇 蘇州 215000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏特色中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，寧夏藥物創(chuàng)新與仿制藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004〕

腦卒中具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)［1-2］，嚴(yán)重威脅人類健康，其中約87%屬于缺血性腦卒中，又稱腦缺血，是指由于各種原因引起的腦供血不足，缺血缺氧導(dǎo)致腦組織的軟化和壞死［3-4］。對(duì)于缺血性腦卒中的治療，目前臨床所用藥物主要為組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）等溶栓藥物，然而由于其適應(yīng)證和治療時(shí)間窗窄，僅有2%～5%腦卒中患者能接受tPA治療，其中50%能達(dá)到再灌注；此外，使用tPA治療恢復(fù)血液供應(yīng)后，其腦功能不但沒有恢復(fù)，反而加重了腦損傷，稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemic/reperfusion injury，CIRI），限制了tPA等溶栓藥物在臨床上的使用。因此，進(jìn)一步尋找療效好、毒性低的抗缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物，仍是目前亟待解決的重大問題。

CIRI的機(jī)制復(fù)雜，大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激在其發(fā)病機(jī)制中有重要作用，再灌注時(shí)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平急劇增加，引起線粒體損傷、鈣超載、線粒體膜電位水平發(fā)生改變、能量代謝障礙和神經(jīng)元凋亡［5-6］。因此，可以通過抑制氧化應(yīng)激，從而減少CIRI［7］。獐牙菜苦苷（swertiamarin，Swe）是從中藥秦艽（Gentianamacrophylla，Pall）中提取的主要活性成分之一。秦艽有多種藥理作用，包括抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤及保護(hù)肝和心腦血管［8-9］。有研究表明，秦艽的水煎液對(duì)家兔全腦缺血損傷模型有一定的保護(hù)作用［10］。Swe具有抗炎、抗氧化和鎮(zhèn)靜等藥理活性［11］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Swe對(duì)CIRI的ICR小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，該作用與激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2），減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)［12］；但對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷是否具有保護(hù)作用未見報(bào)道。因此，本研究通過建立PC12細(xì)胞OGD/R損傷模型，探討Swe的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 PC12細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供。將PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基置含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

Swe（純度＞99%），北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；MTT、Fluo-3 AM熒光探針鈣離子濃度檢測(cè)試劑盒和JC-1熒光探針線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司；胎牛血清和胰蛋白酶，美國Gibco公司；尼莫地平（nimodipine）注射液，德國 Bayer公司；Earle’s平衡鹽溶液（Earle′s balanced salt solution，EBSS），北京博奧拓達(dá)科技有限公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，瑞士Roche公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3和活化胱天蛋白酶3多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，英國Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱（HF160W），力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；酶標(biāo)儀（Model 550），美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；倒置顯微鏡（BH-NIC-B），日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；激光共聚焦顯微鏡（TCS-SP），德國萊卡顯微系統(tǒng)有限公司。

考慮到環(huán)境中光線條件的影響，物體本身的顏色會(huì)發(fā)生變化，具體到本研究的具體做法是在普通攝像頭采集酶標(biāo)板區(qū)域圖像時(shí)，將酶標(biāo)板放在一塊均勻的Led燈板上，使酶標(biāo)板孔受到均勻的光照這樣可以減少光線等環(huán)境因素帶來顏色特征值計(jì)算的誤差.

1.3 PC12細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組〔（98.3±1.6）%〕比較，OGD/R模型組細(xì)胞存活率顯著降低至（46±4）%（P＜0.01）；Swe 1和10 μmol·L-1組細(xì)胞存活率分別為（58±3）%和（65.5±1.6）%，尼莫地平組為（67.7±2.6）%，與模型組比較，均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，OGD/R模型組PC12細(xì)胞ROS和 MDA 水平顯著升高（P＜0.01），SOD，CAT和GSH-Px的活性顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 0.1，1 和 10 μmol·L-1組及尼莫地平組細(xì)胞ROS和MDA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD，CAT 和 GSH-Px的活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

1.4 MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率

將PC12細(xì)胞接種在96孔板中，每孔6×103細(xì)胞，細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥同1.3，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），在培養(yǎng)箱中孵育4 h，輕輕吸掉上清，加入DMSO溶液150 μL，震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)定各組吸光度值（A490nm）。

1.5 比色法檢測(cè)PC12細(xì)胞LDH漏出率

LDH漏出率檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組〔（5.5±1.1）%〕比較，OGD/R模型組LDH漏出率增加至（19.4±1.2）%（P＜0.01）；與模型組比較，Swe 1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組LDH漏出率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

1.6 Fluo-3AM熒光探針法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

將PC12細(xì)胞接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照組、OGD/R模型組和Swe（10 μmol·L-1）組。細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和給藥方法同1.3。按全蛋白提取試劑盒說明操作，裂解細(xì)胞，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白含量，通過10% SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉孵育封閉2 h后加入一抗（Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶3抗體分別以1∶1000，1∶1000，1∶800和1∶500稀釋），4℃孵育過夜；加入二抗（1∶2000稀釋）室溫孵育2 h，ECL顯色后曝光檢測(cè)蛋白條帶印跡。利用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶積分吸光度值，用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。用活化蛋白與總蛋白條帶積分吸光度值的比值表示蛋白活化水平。

上式通過將低值變異概率動(dòng)態(tài)賦予低適應(yīng)度個(gè)體，促使其發(fā)生變異，有效保護(hù)了優(yōu)異個(gè)體。在與變異概率比較后，再揀選n對(duì)個(gè)體，利用配對(duì)算子遺傳形成子代新個(gè)體。當(dāng)前配對(duì)算子中，擴(kuò)展算術(shù)配對(duì)算子通用性較好[19]，計(jì)算公式為：

1.7 JC-1熒光探針法檢測(cè)PC12細(xì)胞線粒體膜電位

將PC12細(xì)胞接種在共聚焦皿中，細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥同1.3。棄培養(yǎng)基，加入根據(jù)試劑盒說明書提前配制好的JC-1染色工作液，在培養(yǎng)箱中染色25 min，之后用JC-1染色緩沖液洗3遍，加入2 mL 1640培養(yǎng)基在顯微鏡下觀察并采集圖像。線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）較高時(shí)，JC-1在線粒體中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；MMP較低時(shí)，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光［13］。通過計(jì)算各組紅、綠熒光強(qiáng)度比值反映PC12細(xì)胞MMP。

1.8 比色法檢測(cè)SOD、CAT和GSH-Px的活性及ROS和MDA的含量

將細(xì)胞種植在35 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥同1.3。棄掉培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS洗1遍。按照試劑盒說明書操作，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)SOD，CAT和GSH-Px的活性及ROS和MDA含量。

通過共建，打造西江流域“公共能量場(chǎng)”，就是在建設(shè)“智慧西江”的基礎(chǔ)上，打造統(tǒng)一監(jiān)管服務(wù)平臺(tái)，建立健全信息共享機(jī)制，為各職能管理部門及航運(yùn)企業(yè)、船員等提供交流溝通渠道和反饋機(jī)制，共同提升西江航運(yùn)公共服務(wù)水平。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.10 Western印跡法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及胱天蛋白酶3活化水平

將細(xì)胞接種在激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥同1.3。PC12細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，用PBS洗3遍，每次5 min，按照試劑盒說明書操作，加入Fluo-3 AM工作液孵育30 min，用PBS洗3遍，用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)527 nm條件下觀察并采集圖像，用Olympus FV10-ASW4.1 Viewer和Image J分析熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響

將PC12細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，棄掉培養(yǎng)液，用EBSS輕輕洗3遍，加入適量的EBSS，置37℃恒溫缺氧箱（95% N2和5% CO2）內(nèi)缺氧4 h（缺氧缺糖）。缺氧結(jié)束后輕輕取出培養(yǎng)皿，棄EBSS，換成常規(guī)1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（再灌注）。

將PC12細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照組、OGD/R模型組、尼莫地平（陽性對(duì)照藥）組和Swe（10 μmol·L-1）組。細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和給藥方法同 11..33。按照AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集PC12細(xì)胞用冷的PBS洗3遍，用400 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC在4℃條件下孵育15 min，最后加入反應(yīng)混合液孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率。

2.2 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞LDH漏出率的影響

細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組給藥同1.3，將PC12細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，然后用胰酶消化收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞15 s，重復(fù)3次得細(xì)胞勻漿，根據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒說明書操作流程，用酶標(biāo)儀在440 nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞勻漿的吸光度值（A440nm）。LDH漏出率（%）=培養(yǎng)液A440nm/（培養(yǎng)液A440nm+細(xì)胞勻漿A440nm）×100%。

2.3 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

圖3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，OGD/R模型組綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.01），提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高；與OGD/R模型組比較，Swe 0.1，1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組綠色熒光強(qiáng)度減弱，提示Ca2+濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

H5假設(shè)成立，感知價(jià)值對(duì)使用意愿的路徑系數(shù)是0.88，說明感知價(jià)值是無現(xiàn)金支付使用意愿的主要影響因素，當(dāng)消費(fèi)者對(duì)無現(xiàn)金支付的整體評(píng)價(jià)較高，其選擇使用無現(xiàn)金支付的意愿就越大，當(dāng)消費(fèi)者整體評(píng)價(jià)不高，其使用意愿就不高。無論從經(jīng)濟(jì)學(xué)理論角度還是數(shù)據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果來看都證實(shí)感知價(jià)值中介變量選取的合理性。

2.4 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞MMP的影響

MMP檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，OGD/R模型組紅/綠熒光比值顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 1和10 μmol·L-1組和尼莫地平組紅/綠熒光比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照組、OGD/R模型組、尼莫地平（陽性對(duì)照藥）組和Swe（0.1，1.0和10.0 μmol·L-1）組。除細(xì)胞對(duì)照組外，其余各組均進(jìn)行OGD/R處理，模型組氧糖剝奪4 h后，換成常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，尼莫地平組再灌注的同時(shí)加尼莫地平12 μmol·L-1，Swe組再灌注的同時(shí)分別加Swe 0.1，1.0 和 10.0 μmol·L-1，細(xì)胞對(duì)照組換成同體積培養(yǎng)基。

式中與分別表征對(duì)于決策專家et而言，應(yīng)急方案epm在指標(biāo)cn下的實(shí)際表現(xiàn)情況相對(duì)于期望水平或最低要求值的損益值，t=1,2,,T，m=1,2,,M，n=1,2,,N。

2.6 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，OGD/R模型組細(xì)胞早期凋亡率和細(xì)胞死亡率明顯增加（P＜0.01）；與OGD/R模型組比較，Swe 10 μmol·L-1和尼莫地平顯著降低細(xì)胞早期凋亡率和細(xì)胞死亡率（P＜0.01）。

2.7 Swe對(duì)OGD/R損傷的PC12細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及胱天蛋白酶3活化水平的影響

Western印跡檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，OGD/R模型組Bcl-2/Bax比值明顯降低（P＜0.01），胱天蛋白酶3活化水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，Swe 10 μmol·L-1組 Bcl-2/Bax比例明顯升高（P＜0.01），胱天蛋白酶3活化水平明顯降低（P＜0.01）。

3 討論

CIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大量研究表明，ROS大量產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激在CIRI的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)健作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Swe在ICR小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型上可抗CIRI，具有神經(jīng)保護(hù)作用［12］，且該作用與激活Nrf2信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究采用PC12細(xì)胞建立氧糖剝奪4 h、再灌注24 h的體外OGD/R模型，MTT法和LDH漏出率檢測(cè)結(jié)果表明，Swe組細(xì)胞存活率明顯升高，LDH漏出率明顯降低，說明Swe可降低OGD/R引起的PC12細(xì)胞損傷。Swe可對(duì)抗OGD/R引起的SOD，GSH-PX和CAT活性降低及ROS和MDA含量增加，說明Swe可以減少PC12細(xì)胞OGD/R引起的氧化應(yīng)激損傷。

隨后，她坐在嶺上的一塊大青石上，曬了一會(huì)陽光，不知為什么，她走走停停，走得越來越慢了。說穿了做賊心虛，心底里還是有點(diǎn)兒提心吊膽的，她努力使自己鎮(zhèn)定下來，以一種淡定的心態(tài)，若無其事地去見她的風(fēng)影和尚，就像什么事也沒有發(fā)生過一樣。這回，她一定要讓他吹一回竹笛子，她要好好的當(dāng)一次聽眾，聽一聽那久違了的笛聲。她深信，這次的笛聲一定比以往任何時(shí)候都要悠揚(yáng)，悅耳動(dòng)聽。她笑了起來，笑得比一株山花還要好看，那就繼續(xù)笑下去，跟山花秀上一回，俊死那滿山的野花。此時(shí)要是帶鏡子，她一定會(huì)照上千回百回。她的身子頃刻之間就化作了一株弱柳，如果沒有風(fēng)扶，肯定會(huì)倒了下去。

線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。腦缺血再灌注會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，使ROS的水平增加，改變線粒體膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。Ca2+超載可引起細(xì)胞損傷，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激，觸發(fā)下游凋亡信號(hào)通路的激活。此外，MMP能反映線粒體的功能和損傷程度，MMP的降低最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14-15］。因此，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和增加MMP可以降低OGD/R引起的PC12細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果表明，Swe顯著抑制OGD/R損傷后PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，提高M(jìn)MP水平。說明Swe能減少OGD/R引起的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和維持線粒體功能。

凋亡是腦缺血再灌注細(xì)胞死亡的主要方式之一。細(xì)胞凋亡受凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的調(diào)節(jié)，其中促凋亡蛋白會(huì)激活下游胱天蛋白酶家族，包括將凋亡執(zhí)行蛋白胱天蛋白酶3激活成為活化的胱天蛋白酶3，從而引起DNA的損傷和細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生［16-18］。文獻(xiàn)報(bào)道，增加Bcl-2/Bax比例，抑制胱天蛋白酶3活化水平可以減少細(xì)胞凋亡［19-21］。本研究中，OGD/R模型組細(xì)胞凋亡率增加，Bcl-2/Bax明顯降低，胱天蛋白酶3活化水平明顯增加，Swe可顯著減少OGD/R引起的PC12細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Swe對(duì)PC12細(xì)胞OGD/R損傷具有保護(hù)作用，且Swe的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，此研究結(jié)果與前期在ICR小鼠體內(nèi)研究結(jié)果相一致，由此說明Swe有可能作為潛在的抗CIRI的神經(jīng)保護(hù)劑。