趙文華，李富祥，楊仕標(biāo)

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

山羊傳染性胸膜肺炎（CCPP）是一種由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）引起的高度接觸性傳染病，流行于亞非各國。在易感羊群中，CCPP 的發(fā)病率和病死率分別達(dá)100%、80%，可對山羊養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的疫病之一[1-3]。CCPP的典型病癥為高熱（41～43 ℃），感染羊群無年齡和性別差異，妊娠母羊易流產(chǎn)[4-5]；病理特征為肺間質(zhì)及間葉水腫。流行地區(qū)的CCPP 診斷比較復(fù)雜，在臨床病理上必須與其他相似的綜合癥狀加以區(qū)分，如小反芻獸疫、巴氏桿菌病等[6-8]。臨床準(zhǔn)確診斷該病通常結(jié)合臨床癥狀與實(shí)驗(yàn)室方法。常用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子生物學(xué)檢測、病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷等[9-10]。其中，進(jìn)行病原分離是確診CCPP最為特異準(zhǔn)確的方法，但Mccp對營養(yǎng)條件要求苛刻，難以體外進(jìn)行分離培養(yǎng)，非專業(yè)實(shí)驗(yàn)室一般無法完成分離鑒定；免疫血清學(xué)檢測方法存在非特異性、實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備要求成本高和不易操作等缺點(diǎn)；病原核酸檢測則可快速確診該病。本研究為建立快速進(jìn)行CCPP臨床檢測的分子生物學(xué)核酸檢測方法，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CCPP 疫苗菌株由哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶老師饋贈(zèng)，巴氏桿菌細(xì)菌為本實(shí)驗(yàn)室自臨床送檢病料分離獲得。

1.2 試劑與儀器

主要儀器：TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction kit、TaKaRa Ex Taq RR001A（大連寶生物工程有限公司）；GeneAmp PCR SYSTEM 9700 普通PCR 儀、ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀、熒光定量PCR 反應(yīng)管（ABI 公司）；Nanovue Plus微量分光光度儀（GE公司）。

主要試劑：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR，RR390A）試劑盒、Goldview 核酸染色劑（大連寶生物工程有限公司）；瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無水乙醇等（分析純，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.3 引物及探針

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]及相關(guān)GenBank 序列設(shè)計(jì)兩對CCPP 普通PCR檢測引物，熒光定量PCR檢測所用引物及探針根據(jù)自測序列及相關(guān)GenBank序列設(shè)計(jì)合成，級別為HPLC級的Taqman探針及引物均由大連寶生物公司合成。采用無RNAase酶的PCR級水溶解合成的引物/探針干粉，制備100 mmol/L的引物/探針貯存濃度、20 mmol/L的引物工作濃度、10 mmol/L的探針工作濃度，-80 ℃貯存。普通PCR引物情況見表1，熒光定量PCR引物情況見表2。

表1 CCPP普通PCR檢測引物Tab.1 Primers of routine PCR for detection of CCPP

表2 CCPP熒光定量PCR引物探針Tab.2 Probe and Primers of real-time PCR for detection of CCPP

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌體基因組DNA提取

按照提取試劑盒說明書操作。收集1.0～5.0×109菌體細(xì)胞，12 000 r/min 離心2 min，棄上清；將180 μL Buffer GL、20 μL Proteinase K 和10 μL RNase A（10 g/L）加入沉淀，混勻，56 ℃溫浴10 min；將上述樣本移入吸附柱，12 000 r/min離心2 min，棄濾液后加入500μL Buffer WA，12 000 r/min 離心1 min，棄濾液；再加入700 μL Buffer WB，室溫靜置1 min，12 000 r/m 離心1 min，棄濾液，循環(huán)2 次。最后將吸附柱安置于一新離心管，將50μL Elution Buffer 加入吸附柱膜中央，室溫靜置3～5 min，12 000 r/min離心2 min 洗脫DNA，棄去吸附柱，收集有DNA 液體的離心管，-80 ℃貯存。

1.4.2 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

CCPP 普通PCR 反應(yīng)液：10×ExTaq buffer 5.0 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、Primer F 1.0μL、Primer R 1.0μL、DNA 1.0μL、H2O 37.5μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)34 次；72 ℃10 min。采用2%瓊脂糖凝膠跑電泳，紫外成像儀檢測擴(kuò)增結(jié)果，拍照記錄。

熒光定量PCR 反應(yīng)液：Premix Ex Taq（Probe qPCR）10.0 μL、Primer 16S-tryF1 0.2 μL、Primer 16S-tryR1 0.2 μL、Probe CCPP 16S 0.4 μL、Rox II 0.2 μL、DNA 1.0μL、H2O 8.0μL。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃20 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4.3 CCPP 普通PCR 擴(kuò)增片段的純化回收、克隆及序列測定

膠回收擴(kuò)增得到的CCPP16S 及arcD基因片段，克隆連接至pMD-18T Vector，挑取陽性克隆，對獲得的陽性克隆進(jìn)行序列測定和BLAST 分析，具體詳細(xì)操作步驟參見相關(guān)的參考文獻(xiàn)[12]和[13]。根據(jù)獲得的基因序列合成熒光定量PCR引物及探針。

1.4.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)

以已構(gòu)建的CCPP-16S 基因pMD-18T 載體質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Nanovue Plus 核酸快速檢測儀測定并計(jì)算原始質(zhì)粒的濃度，制備108～100copies/μL 共9 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建CCPP-16S標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測敏感性、重復(fù)性。

1.4.5 特異性試驗(yàn)及臨床樣本檢測

除對CCPP疫苗株、臨床樣本進(jìn)行熒光定量檢測外，還對臨床上極易混淆的巴氏桿菌等進(jìn)行鑒別檢測，以驗(yàn)證探針及配套引物對的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCPP普通PCR擴(kuò)增片段的純化回收、克隆及序列測定（見圖1）

由圖1可知，根據(jù)表1所設(shè)計(jì)的兩對引物對CCPP疫苗株DNA 進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，均有預(yù)期大小片段擴(kuò)增出。將各預(yù)期片段膠回收、純化，克隆連接至pMD-18T Vector獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定和分析；所測序列經(jīng)網(wǎng)上BLAST 比對，均為CCPP 相應(yīng)基因片段的正確序列。根據(jù)所測序列設(shè)計(jì)合成位于16S 基因片段的一對引物和配套探針見表2。

圖1 CCPP疫苗株兩對引物普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of routine PCR of CCPP vaccine strain amplified with the two primer sets

2.2 CCPP-16S 熒光探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建（見圖2～圖4、表3）

由圖2 可知，在103～108copies/μL 濃度之間標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度的對數(shù)與Ct 值之間存在良好的線性關(guān)系，CCPP-16S 探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式表達(dá)為：Y=-3.323 058X+41.844 292，R2=0.998 517，擴(kuò)增效率為99.95%。上述方程式中Y為Ct值，X為拷貝數(shù)的對數(shù)，R2為相關(guān)系數(shù)。

圖2 CCPP-16S質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of CCPP-16S standard plasmids real-time PCR

由圖3可知，以Ct值35為陽性樣品臨界值，則CCPP-16S 探針對樣本的檢測敏感性可低至102.06copies/μL。由圖4可知，利用配套引物對進(jìn)行普通PCR檢測時(shí)檢測敏感度僅為104copies/μL，較實(shí)時(shí)熒光定量法的敏感度低近100 倍。以 優(yōu) 化 的 反 應(yīng) 條 件 選 取103、104、105、106、107copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板分別連續(xù)擴(kuò)增3次，結(jié)果顯示，每個(gè)梯度的樣本重復(fù)性均較好。

圖3 CCPP-16S質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.3 Dynamic curve of CCPP-16S standard plasmids

圖4 CCPP-16S普通PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensibility test results of CCPP-16S routine PCR

由表3 可知，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.5%，說明該方法具有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

表3 熒光定量PCR CCPP-16S質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Repeatability test results of real-time PCR for CCPP-16S standard plasmids

2.3 特異性檢測及初步臨床應(yīng)用（見圖5）

由圖5 可知，本研究建立的CCPP-16S 熒光定量PCR方法僅對CCPP有特異性熒光信號檢出，而陰性對照、巴氏桿菌均無熒光信號測出。

圖5 CCPP-16S Taqman探針熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.5 Results of CCPP-16S Taqman probe real-time PCR

3 討論

隨著技術(shù)進(jìn)步，各種疫病的檢測均需實(shí)現(xiàn)快速、高效，以便及時(shí)應(yīng)對疫情、準(zhǔn)確處置，將損失降至最低。CCPP的病死率極高，危害極其嚴(yán)重，臨床診斷中易混淆的疫病也很多；目前，國內(nèi)外對CCPP 的診斷主要依靠病原分離鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)[14-16]。對比3 類診斷方法可知，傳統(tǒng)的分離鑒定方法因支原體生長速度慢且生長條件苛刻等特點(diǎn)，無法立即解決快速診斷的問題；而間接血凝試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)與競爭ELISA 等血清學(xué)試驗(yàn)，因敏感性或特異性較差等缺陷問題，亦無法作為診斷該病原的快檢方法。分子生物學(xué)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，尤其是新近發(fā)展起來的熒光定量PCR 診斷技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種飛速發(fā)展且廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)的快速定性、定量的檢測技術(shù)。相對傳統(tǒng)的基于抗體而建立的血清學(xué)檢測方法及普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有更快速更靈敏的優(yōu)勢，可通過檢測病原遺傳物質(zhì)“核酸”對疫病進(jìn)行快速確診，進(jìn)而及時(shí)制定疫情處置措施制定相應(yīng)的治療方案。

4 結(jié)論

本研究基于Mccp 16S rRNA基因初步建立可對CCPP進(jìn)行快速特異性檢測的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，可快速特異性確診CCPP，但仍需大量臨床樣本進(jìn)行方法的驗(yàn)證和進(jìn)一步的條件優(yōu)化。本方法的初步建立為CCPP的快速高通量臨床檢測提供了一定的技術(shù)參考。