高春景 楊洋 闞宗衛(wèi) 成松 魏素梅 胡凱

目前，耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐藥結(jié)核病(Rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)仍然是全球結(jié)核病控制工作所面臨的嚴(yán)峻問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估算，2018年全球新增約50萬利福平耐藥結(jié)核病病例，估算其中中國新增利福平耐藥結(jié)核6.6萬例，我國也是MDR-TB和RR-TB 30個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一，MDR-TB和RR-TB的疫情非常嚴(yán)重[1]，因此利福平(Rifampicin,RIF)耐藥的早期診斷尤其重要。Xpert MTB/RIF檢測是一種自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，使用覆蓋rpoB基因RRDR核心區(qū)的五個(gè)重疊的分子信標(biāo)探針來實(shí)現(xiàn)結(jié)核病和利福平耐藥的檢測，約2h可以得到結(jié)果[2]。2014年WHO推薦該技術(shù)用于多種結(jié)核病的診斷及利福平耐藥檢測[3]。本研究旨在分析Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥的診斷價(jià)值及rpoB基因的突變特點(diǎn)，現(xiàn)匯報(bào)如下。

資料與方法

一、研究對象

回顧性納入2016年1月至2020年6月期間來院就診患者相同標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)和Xpert MTB/RIF檢測，且任一種方法檢出MTB。

二、研究方法

1.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：采用改良羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)并行菌種鑒定及比例法藥物敏感試驗(yàn)(培養(yǎng)藥敏)，具體步驟按照《手冊》[4]進(jìn)行。

2.Xpert MTB/RIF檢測：具體操作步驟按照Cepheid公司的Gene Xpert儀器說明書[5]進(jìn)行。結(jié)果判讀：①5條探針結(jié)合的是野生型結(jié)核分枝桿菌，至少兩條探針結(jié)合到標(biāo)本提取出的DNA上，就表示檢測到結(jié)核分枝桿菌，MTB這一項(xiàng)檢測結(jié)果就會(huì)報(bào)告陽性；②A-E探針有1條或者多條探針陰性，即該探針沒有結(jié)合到患者樣本DNA上進(jìn)行擴(kuò)增，則代表患者樣本中的結(jié)核分枝桿菌的探針相對應(yīng)的rpoB基因片段有發(fā)生突變，阻止利福平對結(jié)核分枝桿菌起作用，即對利福平產(chǎn)生了耐藥結(jié)果；③當(dāng)5條探針均結(jié)合到患者樣本DNA上，擴(kuò)增，均為陽性時(shí)，代表MTB檢出，同時(shí)對利福平敏感。

3.治療史：根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 196-2017[6]分為初治和復(fù)治。

4. 統(tǒng)計(jì)方法:根據(jù)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料采用率表示,組間采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩種檢驗(yàn)方法的一致率=(觀察符合例數(shù)/觀察總例數(shù))×100%；兩種檢驗(yàn)方法的一致性采用Kappa檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、收集2016年1月至2020年6月期間來院就診患者相同標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了培養(yǎng)藥敏和Xpert MTB/RIF檢測共7659例, Xpert MTB/RIF法檢出MTB 4236例，培養(yǎng)法檢出MTB 3752例；兩種方法檢測MTB的結(jié)果對比分析(見表1)。兩種方法同時(shí)檢出MTB共3621例：培養(yǎng)藥敏法檢出利福平耐藥238例，Xpert MTB/RIF法檢出利福平耐藥262例；兩種方法檢出利福平耐藥的結(jié)果對比分析(見表2)。

表1 Xpert MTB/RIF法與培養(yǎng)法檢測MTB結(jié)果的比較

通過配對χ2檢驗(yàn)，兩種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), Xpert MTB/RIF檢測的陽性檢出率高。

表2 Xpert MTB/RIF法與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥結(jié)果的比較

兩種檢驗(yàn)方法的一致率為99.01%；采用Kappa 檢驗(yàn)，K值=0.92，兩種方法的檢測結(jié)果完全符合，一致性很好。

二、Xpert法檢出利福平耐藥262例，其中男性190例，年齡16～83歲，中位數(shù)34.5歲；女性72例，年齡14～82歲，中位數(shù)28.5歲。其中有19例未發(fā)現(xiàn)A-E探針突變，但結(jié)果示利福平耐藥；243例發(fā)現(xiàn)探針突變，探針突變的發(fā)生率分別為E探針63.37%(154/243)、D探針20.16%(49/243)、B探針8.23%(20/243)、A探針4.53%(11/243)、C探針0.82%(2/243)、聯(lián)合探針突變2.88%(7/243)；7例聯(lián)合探針突變分別為BE、CE、AB、AD、ACE各1例及2例DE。Xpert法利福平耐藥探針突變與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥的結(jié)果對比分析(見表2)。

三、243例存在探針突變的RR-TB病例中，初治為65.02%(158/243)，復(fù)治為34.98%(85/243)；初治RR-TB病例中，探針突變的發(fā)生率分別為E探針61.39%(97/158)、D探針21.52%(34/158)、B探針8.23%(13/158)、A探針5.70%(9/158)、C探針0.63%(1/158)、聯(lián)合探針突變2.53%(4/158)；復(fù)治RR-TB病例中，探針突變的發(fā)生率分別為E探針67.06%(57/85)、D探針17.65%(15/85)、B探針8.24%(7/85)、A探針2.35%(2/85)、C探針1.18% (1/85)、聯(lián)合探針突變3.53%(3/85)；初治4例聯(lián)合探針突變分別為ACE、DE、BE、CE,復(fù)治3例聯(lián)合探針突變分別為AD、AB、DE；RR-TB不同探針突變特點(diǎn)與治療史的關(guān)聯(lián)性分析(見表3、4)。

表3 Xpert探針突變與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥結(jié)果的對比

以培養(yǎng)藥敏結(jié)果為利福平耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，兩組比較，χ2=34.26，P<0.01,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Xpert無探針突變組利福平耐藥的準(zhǔn)確性要顯著低于有探針突變組。

表4 不同探針突變特點(diǎn)與治療史的關(guān)聯(lián)性分析

兩組間比較采用Fisher確切概率法，P<0.01,初治與復(fù)治組不同探針突變比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

四、Xpert MTB/RIF檢測不同樣品探針的曲線是不同的，與樣品中結(jié)核菌的DNA模板起始濃度有關(guān)。Gene Xpert儀器顯示的不同探針突變的代表性曲線(見圖1-6)。

討 論

目前耐多藥結(jié)核病正在成為全球性的威脅，WHO報(bào)道利福平耐藥結(jié)核中78%為耐多藥結(jié)核[1]，WHO《耐藥結(jié)核病治療指南》[7]中推薦RR-TB及MDR-TB的化療方案是一樣的，因此早期診斷利福平是否耐藥對結(jié)核病治療方案的制定尤為重要。Xpert MTB/RIF檢測作為一種能同時(shí)對結(jié)核病診斷及利福平耐藥檢測的快速簡便的方法,在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外許多研究[8-10]顯示Xpert MTB/RIF檢測對結(jié)核病的診斷有很高的敏感度和特異度。本研究未再對Xpert MTB/RIF檢測對結(jié)核病的診斷的敏感度和特異度進(jìn)行分析，但是在7659例標(biāo)本中Xpert MTB/RIF的陽性檢出率要高

圖1 C探針突變的曲線

1.無探針突變的曲線；2.A探針突變的曲線；3.B探針突變的曲線；4.C探針突變的曲線；5.D探針突變的曲線；6.E探針突變的曲線

于培養(yǎng)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與王啟明等[11]的研究不一致，這可能與本研究的培養(yǎng)方法為改良羅氏培養(yǎng)法，而王啟明等的研究采用的液體培養(yǎng)法有關(guān)，因?yàn)橐后w培養(yǎng)的陽性率要高于改良羅氏培養(yǎng)法。本研究顯示Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥與培養(yǎng)藥敏的一致率達(dá)到99.01%，采用Kappa 檢驗(yàn)，兩種方法的檢測結(jié)果完全符合，而且Xpert MTB/RIF檢測用時(shí)較短，一般僅需2h左右，因此Xpert MTB/RIF可以快速有效的診斷利福平耐藥結(jié)核，對方案的早期制定有重要價(jià)值。

Xpert MTB/RIF檢測和培養(yǎng)藥敏檢測利福平耐藥結(jié)果亦存在不一致的情況，本研究有6例Xpert利福平敏感而培養(yǎng)藥敏示利福平耐藥，這是因?yàn)閄pert MTB/RIF檢測僅僅覆蓋了rpoB基因RRDR核心區(qū)，而Musser等報(bào)道[12]只有95%利福平耐藥突變位于rpoB序列中RRDR核心區(qū)。本研究有30例Xpert利福平耐藥而培養(yǎng)藥敏示利福平敏感，胡族瓊等[13]研究發(fā)現(xiàn)rpoB有8種無意義的錯(cuò)義突變存在于4 株利福平敏感株中,認(rèn)為這種無意義的突變,將導(dǎo)致利用分子診斷技術(shù)檢測利福平耐藥出現(xiàn)假陽性的可能；而Noura等[14]及Singhal等[15]研究發(fā)現(xiàn)rpoB 81bp核心區(qū)的L511P、D516Y、H526N、H526L、H526S和L533P等突變可能提示利福平耐藥，而培養(yǎng)藥敏結(jié)果是利福平敏感的，通過檢查耐多藥結(jié)核菌株的利福平耐藥基因型，以便對患者進(jìn)行最佳治療是有必要的。

Xpert MTB/RIF檢測是通過覆蓋rpoB基因RRDR核心區(qū)A-E五條探針是否突變來實(shí)現(xiàn)利福平耐藥的檢測的，五條探針覆蓋的密碼子分別為：A(密碼子507-511)，B(密碼子512-518)，C(密碼子518-523)，D(密碼子523-529)和E(密碼子529-533)[2]。本研究顯示利福平耐藥結(jié)核探針突變發(fā)生的頻率為E>D>B>A>聯(lián)合探針>C，其中E探針突變率最高達(dá)到63.37%，其次是D探針20.16%、B探針8.23%，而C探針突變最少。Zaw等的一篇綜述分析顯示rpoB基因的RRDR中最常見的突變密碼子是531、526和516[16],而三個(gè)密碼子分別位于E、D、B三個(gè)探針的覆蓋區(qū)，本研究顯示E、D、B三條探針突變頻率與531、526和516密碼子突變頻率是一致的，三條探針的總突變率占91.76%。本研究顯示利福平耐藥結(jié)核不管是初治還是復(fù)治A-E五條探針突變的頻率大小順序是一致的，均為E>D>B>A>C。但兩組比較，探針突變的頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A、D探針突變初治組要高于復(fù)治組，E探針突變初治組要低于復(fù)治組，B探針突變兩組頻率基本一致，C探針兩組各一例，聯(lián)合探針突變初治組低于復(fù)治組，初治組的4例聯(lián)合探針突變均含有E探針突變，而復(fù)治3例聯(lián)合探針突變僅有1例合并E探針突變；而Uddin等的研究顯示初治患者只有E探針突變，且聯(lián)合探針突變僅見于復(fù)治患者[17]，這可能與不同國家和地區(qū)耐藥的原因有一定關(guān)系，本研究顯示本院原發(fā)耐藥占65.02%，原發(fā)感染占比較高，進(jìn)一步表明早期發(fā)現(xiàn)并治療耐藥結(jié)核，控制傳染源，有助于本地區(qū)控制耐藥結(jié)核病疫情的傳播。

本研究顯示XpertXpert MTB/RIF法檢出利福平耐藥的262例中存在有19例未發(fā)現(xiàn)A-E探針突變，但結(jié)果示利福平耐藥,這種結(jié)果是存在的，其原因是：機(jī)器判讀結(jié)果除了根據(jù)探針是否結(jié)合，有沒有突變存在之外,也會(huì)判讀Ct值最高的一條探針和Ct值最低的一條探針之間的差值，如果差值>4.0，則認(rèn)為濃度差異明顯，有一條探針存在突變可能，就會(huì)報(bào)告利福平耐藥的結(jié)果[2]。但本研究顯示19例未發(fā)現(xiàn)探針突變，而結(jié)果示利福平耐藥病例中，有10例培養(yǎng)藥敏結(jié)果為利福平敏感，如果以培養(yǎng)藥敏結(jié)果為利福平耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)， Xpert無探針突變組利福平耐藥的準(zhǔn)確性要明顯低于有探針突變組。由于本研究為回顧性研究，19例病例未進(jìn)行復(fù)檢，也未進(jìn)行其它分子生物學(xué)檢測，是否存在利福平耐藥基因突變不得而知，需要進(jìn)一步的研究。

總之，本研究結(jié)果顯示利福平耐藥結(jié)核探針突變主要發(fā)生在E探針和D探針，C探針突變最少。利福平原發(fā)耐藥比例較高，Xpert MTB/RIF檢測可以快速有效的診斷利福平耐藥結(jié)核，有助于早發(fā)現(xiàn)、早治療，有利于阻止耐藥結(jié)核病的傳播，減少原發(fā)感染的可能。