洪煜宇，楊慧山，譚偉軍

（1.廣東省清遠市動物疫病預防控制中心，廣東 清遠 511518；2.佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000）

工業(yè)生產的原材料或終產品為日常生活提供許多便利，但也不可避免地產生了一些環(huán)境污染問題。六氟雙酚A（BPAF）主要應用于制常見的塑料制品造聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂，如食品包裝、玩具、牙科材料、耐熱耐高溫的工業(yè)材料[1-2]。BPAF具有雌激素樣活性，作為一種環(huán)境中的內分泌干擾物質（EEDs），已被證明能夠引發(fā)動物以及人類的生殖發(fā)育毒性[3-4]。Caroline等[5]研究表明，BPAF可引起斑馬魚的雌激素樣毒性，但其毒性機制尚無進一步深入探討。因此，本研究以斑馬魚的肝臟細胞作為研究模型，探討B(tài)PAF對斑馬魚的毒性機制，進一步為BPAF的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：六氟雙酚A 購自美國sigma 公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，均購自中國南京建成生物工程研究所；逆轉錄試劑盒以及熒光定量試劑盒購自TaKaRa 公司；胎牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibico公司。

主要儀器：二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、微孔板酶標儀（Thermo fisher）；高速冷凍離心機（Eppendorf）；7500Fast實時熒光定量儀（ABI公司）。

1.2 試驗材料

斑馬魚肝臟細胞系ZFL細胞（ATCC）購自國家斑馬魚資源中心。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 ZFL細胞毒性試驗

取對數增長期的ZFL細胞，消化后按照8×103個/孔的ZFL 細胞接種在96 孔板中，以每孔100μL 的含10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。28 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約12～24 h，待細胞生長至對數生長期，設置不同濃度的BPAF 濃度（0、1、5、10、20、30、40、50μmol/L），以0 濃度組為對照組；每孔重復6 次，24 h 后按照空白培養(yǎng)基∶CCK-8 試劑為10∶1 的比例加入CCK-8，28 ℃、5%CO2培養(yǎng)約3～4 h，450 nm波長檢測各組OD值。

1.3.2 ZFL細胞的氧化應激水平

將ZFL 細胞接種在100 mm 的培養(yǎng)皿中，待細胞生長至 對 數 增 長 期，設 置 不 同 的BPAF 濃 度（0、10、20、30μmol/L），以0 濃度組為對照組；每組設置3 個重復，處理24 h，胰酶收集各組細胞，通過超聲儀破碎裂解細胞，于4 ℃冰上檢測細胞的CAT、SOD、GSH-Px 活性以及MDA含量，并檢測細胞內的蛋白濃度。

CAT、SOD、GSH-Px 活性以及MDA 含量的檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.4 數據統計與分析

數據采用SPSS 22.0 軟件進行t 檢驗及單因素方差（ANOVA）分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 BPAF對ZFL細胞活性的影響（見圖1）

由圖1 可知，與對照組相比，10、20、30、40、50μmol/L BPAF組細胞活性極顯著下降（P＜0.01），且呈BPAF依賴性的濃度下降趨勢。當BPAF的濃度為40μmol/L時，ZFL細胞活性下降了55.51%，接近半數致死量。因此，以下試驗選擇0、10、20、30μmol/L作為BPAF的研究濃度。

圖1 BPAF對ZFL細胞活性的影響Fig.1 Effect of BPAF on ZFL cell viability

2.2 BPAF對ZFL細胞的MDA含量、GSH-Px活性的影響（見圖2）

圖2 BPAF對ZFL細胞的MDA含量、GSH-Px活性的影響Fig.2 Effect of BPAF on the content of MDA and activity of GSH-Px in ZFL cells

由圖2（a）可知，與對照組相比，10μmol/L BPAF 組細胞MDA含量顯著提高（P＜0.05），20、30μmol/L BPAF組細胞MDA 含量極顯著提高（P＜0.01）。由圖2（b）可知，與對照組相比，20、30μmol/L BPAF 組GSH-Px 活性極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 BPAF對ZFL細胞CAT、SOD活性的影響（見圖3）

由 圖3（a）可 知，與 對 照 組 相 比，10、20、30 μmol/L BPAF 組細胞CAT 活性均極顯著降低（P＜0.01）。由圖3（b）可知，20、30 μmol/L BPAF 組細胞SOD活性極顯著降低（P＜0.01）。

圖3 BPAF對ZFL細胞CAT、SOD活性的影響Fig.3 Effect of BPAF on the activities of CAT and SOD in ZFL cells

3 討論

雙酚類化合物作為日常生活中經常接觸的工業(yè)化合物，主要應用于合成環(huán)氧樹脂以及聚碳酸酯等分子材料，已被證明是一類對人類及動物健康有影響的內分泌干擾物[6]。BPAF 作為BPA 中的新興高分子材料，廣泛應用于日常塑料制品中[7]。研究表明，BPAF可造成哺乳動物的生殖毒性以及肝毒性[1]。

氧化應激指細胞內的氧化水平及抗氧化水平失去平衡。Lei等[8]研究發(fā)現，BPAF可引起乳腺癌細胞MCF-7的活性氧水平上升，造成細胞內的氧化應激。MDA 是脂質過氧化物[9]，CAT 和SOD 是細胞內的一類抗氧化酶[10]，均可作為細胞內的抗氧化水平的標志物。GSH-Px作為細胞中合成的最豐富的低分子量硫醇化合物，可通過清除自由基保護細胞免受氧化損傷[11]。本試驗中選擇了具有顯著毒性作用的BPAF 作為ZFL 細胞的研究濃度，以MDA 含量和GSH-Px活性分析ZFL細胞內的氧化應激水平，可知BPAF 引起了ZFL 細胞內的氧化應激。通過CAT 及SOD分析細胞內的抗氧化水平，發(fā)現ZFL細胞中的抗氧化水平下降，標志著氧化應激及抗氧化水平下降情況下，BPAF導致了ZFL細胞內的氧化損傷。

4 結論

本研究結果表明，BPAF 可通過促使斑馬魚肝臟細胞的MDA 含量上升，GSH-Px、CAT、SOD 活性下降，導致ZFL發(fā)生氧化損傷，導致細胞產生細胞毒性。