鄭鈞文，張 文，成 靜，黎 江，胡庭俊

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

辣蓼為一年生草本植物，廣泛分布于我國各省[1-2]，具有消炎鎮(zhèn)痛、抑菌殺蟲、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[3-5]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)牧林漁等行業(yè)[6-9]。黃酮類化合物是辣蓼重要的活性成分之一。近年來，為提高辣蓼黃酮提取率，相關(guān)研究人員對其提取方式進(jìn)行了大量探索，如索式提取法、加熱回流提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法等。因使用設(shè)備及操作方式不同，各種提取方式各有優(yōu)劣[10-12]。

為優(yōu)化辣蓼黃酮提取工藝、降低提取成本，本研究采用乙醇溶液作為溶劑，對辣蓼藥材進(jìn)行加熱回流提取，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定其蘆丁、槲皮素、槲皮苷含量，采用正交試驗(yàn)法研究料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)和提取時(shí)間對辣蓼黃酮濃縮液中黃酮含量的影響，尋找最佳提取條件，為辣蓼黃酮的規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品

辣蓼（廣西壯族自治區(qū)玉林市中藥市場）、水溶性二氧化硅（廣西普大動(dòng)物保健品有限公司）。

蘆丁對照品（100080-201811）、槲皮素對照品（100081-201610）、槲皮苷對照品（111538-201606），均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 主要儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（Waters 公司）、Waters 2998 二極管陣列檢測器（Waters 公司）、RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司）、CD-UPT-II-20 L 純水儀（成都越純科技有限公司）、SB-5200 DTDN超聲波清洗器（寧波新芝科技股份有限公司）、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣蓼黃酮提取液的制備

根據(jù)羅文涓等[13]、朱瑜等[14]有關(guān)辣蓼黃酮分離提取工作的基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取方法。

稱取50 g辣蓼藥材于冷凝回流裝置，按設(shè)定的相應(yīng)條件（料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)和提取時(shí)間）對辣蓼進(jìn)行提取。添加相應(yīng)體積和濃度的乙醇溶液將辣蓼藥材浸泡0.5 h，80 ℃水浴加熱提取。所得提取液以8 層紗布過濾，保留濾液，向剩下的濾渣中加入相同體積、濃度的乙醇溶液，再次水??；合并幾次濾液，以20～25μm定性濾紙抽濾，取濾液減壓（70 ℃，真空度為-0.09 MPa）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至80 mL 以下，加蒸餾水補(bǔ)至80 mL，制得辣蓼黃酮濃縮液。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 L9(34)orthogonal test factor level design

1.2.2 蘆丁、槲皮素、槲皮苷的含量測定

1.2.2.1 色譜條件

選用Waters X Bridge C18（4.6 mm×250 mm,5μm）色譜柱，A 相為UP 水，B 相為甲醇，C 相為0.3%磷酸溶液，D 相為乙腈；C 相∶D 相=84%∶16%；柱溫30 ℃，等度洗脫，洗脫時(shí)間為80 min，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積為20μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備

精密稱量蘆丁、槲皮素和槲皮苷5 mg，分別加入甲醇制備0.50 g/L標(biāo)準(zhǔn)品母液。

分別抽取2 mL 3種母液加甲醇定容至10 mL，即得含量為0.10 g/L的蘆丁、0.10 g/L槲皮素、0.10 g/L槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別抽取2 mL 3 種母液，加甲醇定容至10 mL，得含量為0.10 g/L 的蘆丁、0.10 g/L 槲皮素、0.10 g/L 槲皮苷，共計(jì)0.30 g/L標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備

取辣蓼黃酮濃縮液1 mL，加甲醇定容至10 mL制得供試品溶液。

1.2.3 辣蓼黃酮提取物的制備及含量計(jì)算

1.2.3.1 辣蓼黃酮提取物的制備

按正交結(jié)果最佳的條件提取制備辣蓼黃酮濃縮液，每50 g 辣蓼藥材經(jīng)醇提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成80 mL 藥液，加入40 g 的水溶性二氧化硅混勻，過40 目篩，55 ℃烘干，既得辣蓼黃酮提取物。

1.2.3.2 干浸膏的制備及得率測定

取10 mL最佳工藝制備的辣蓼黃酮濃縮液，55 ℃烘干恒重，精密稱量，計(jì)算干浸膏得率。

式中：W為干浸膏質(zhì)量，V1為濃縮液總體積，Wn為藥材總質(zhì)量，V2為取樣體積。

以所得蘆丁、槲皮苷、槲皮素總質(zhì)量為主指標(biāo)（權(quán)重系數(shù)0.7），干浸膏得率為次指標(biāo)（權(quán)重系數(shù)0.3）對辣蓼黃酮正交提取工藝進(jìn)行綜合評分。

干膏得率越高，說明提取的雜質(zhì)越多，不利于制劑工藝的成型。因此，以干膏得率越低評分越高，綜合評分以百分制表示。

式中：W1為辣蓼黃酮濃縮液中蘆丁、槲皮苷和槲皮素總質(zhì)量；Wh為辣蓼黃酮濃縮液中蘆丁、槲皮苷和槲皮素最大含量；Wx為干浸膏得率；Wt為干浸膏最大得率。

1.2.3.3 辣蓼黃酮提取物中黃酮含量

計(jì)算加入二氧化硅的辣蓼黃酮提取物中黃酮的含量。

式中：W1為辣蓼黃酮提取物中所含蘆丁、槲皮素和槲皮苷總含量；W2為辣蓼黃酮提取物總質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果（見表2、表3）

由表2、表3 可知，4 個(gè)因素的影響大小依次為A＞B＞C＞D、A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C1＞C2、D3＞D1＞D2。

表2 辣蓼黃酮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of extraction process of Polygonum hydropiper flavonoids

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

最佳提取工藝為A3B3C3D3，即料液比1∶20、乙醇濃度80%、提取3次、每次提取2 h。

2.2 最佳工藝制備的辣蓼黃酮提取物含量

采用最佳正交工藝A3B3C3D3制備得80 mL 辣蓼黃酮濃縮液，加入40 g 水溶性二氧化硅，過40 目篩烘干，得43.48 g辣蓼黃酮提取物，總有效成分質(zhì)量為3256.64 mg。

按公式（3）計(jì)算，最佳制備工藝得到的辣蓼黃酮提取物中含7.48%的辣蓼黃酮。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（見表4）

表4 辣蓼黃酮提取物制備工藝驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Validation results of preparation process of Polygonum hydropiper flavonoids extract

由表4 可知，平均干浸膏得率為65.86%，平均總有效成分質(zhì)量為3 268.44 mg，制得的辣蓼黃酮提取物平均含7.51%的辣蓼黃酮。結(jié)果表明，按此工藝提取辣蓼黃酮可靠、穩(wěn)定。

3 討論

蘆丁、槲皮苷和槲皮素是辣蓼黃酮中主要的生物活性成分。因此，本研究選擇蘆丁、槲皮苷和槲皮素的總含量作為辣蓼醇提物中黃酮含量的評價(jià)指標(biāo)。田歡等[15]對葡萄籽中的蘆丁進(jìn)行提取的研究結(jié)果表明，80 ℃條件下，蘆丁具有最佳提取效果。呂海濤等[16]研究發(fā)現(xiàn)，以甲醇為溶劑，溫度低于80 ℃時(shí)，槲皮素的提取量隨溫度升高而增加。楊秀利等[17]研究表明，溫度為80 ℃時(shí)，蕁麻中槲皮苷的提取率最高。因此，本研究直接選用80 ℃作為提取溫度，并選擇極性較大、價(jià)格相對低廉、無毒、可回收的乙醇作為溶劑對辣蓼黃酮進(jìn)行提取。

黃酮含量的測定常采用紫外分光光度法和HPLC 法。中藥提取試驗(yàn)中產(chǎn)生的相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)較多，相較紫外分光光度法，HPLC法能夠更準(zhǔn)確、有效地對藥物成分進(jìn)行分離，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確[18]。實(shí)際操作中HPLC 法節(jié)省人力和時(shí)間、操作簡便。因此，本研究選擇HPLC法對辣蓼黃酮中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測定。

此前試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本研究中流動(dòng)相C 相（0.3%的磷酸溶液）與D相（乙腈）比例為76∶24以上，槲皮苷與槲皮素已具有良好的分離度，但是蘆丁的分離度不佳；在逐步增加流動(dòng)相比例的過程中，蘆丁處的分離度趨好；但超過84∶16時(shí)，最晚出峰的槲皮素拖尾嚴(yán)重，且槲皮素出峰時(shí)間過晚即增加測定時(shí)間，故以84∶16的比例為最佳。

辣蓼黃酮提取物是由醇提法提取的辣蓼黃酮濃縮液，經(jīng)水溶性二氧化硅賦型得到的單方制劑。本研究以HPLC法對辣蓼黃酮濃縮液中所含蘆丁、槲皮苷和槲皮素總量進(jìn)行測定，將黃酮含量作為主指標(biāo)，干浸膏得率作為次指標(biāo)探究不同提取條件對辣蓼黃酮提取的影響。經(jīng)正交試驗(yàn)確定，辣蓼黃酮乙醇提取法最佳工藝為A3B3C3D3，即料液比為1∶20、乙醇濃度為80%、加熱提取3 次、每次提取2 h。利用HPLC法測得在此工藝條件下提取辣蓼所得主要黃酮成分為槲皮苷和蘆丁，每50 g 辣蓼藥材可提取得到約0.65 g蘆丁、2.62 g槲皮苷，未檢出槲皮素。按本研究最佳工藝提取辣蓼藥材的蘆丁含量遠(yuǎn)高于李明[19]對來自16 個(gè)產(chǎn)地的辣蓼提取測得的蘆丁含量（0.657 8～0.997 5 mg/g）；本研究提取得到的槲皮苷含量也遠(yuǎn)高于張宏武等[20]對水辣蓼藥材測得的0.083 6%～0.587 4%的槲皮苷含量。

除最佳工藝提取的辣蓼黃酮濃縮液未檢出槲皮素外，本研究中其他正交提取條件下制備得到的辣蓼黃酮濃縮液中均未檢出槲皮素。于曉亮等[21]研究表明，不同月份采收的同產(chǎn)地辣蓼中各種化學(xué)成分具有差異性，不同產(chǎn)地、不同部位的辣蓼所含化學(xué)成分亦有不同。何立美等[22]研究表明，廣西玉林所產(chǎn)的辣蓼中蘆丁、槲皮苷、槲皮素的含量由大到小依次為槲皮苷＞蘆?。鹃纹に?，與本研究結(jié)果相一致；且玉林辣蓼中的槲皮素含量僅為32.66μg/g，這可能是本研究未檢測出槲皮素的原因。但按照本研究中的最佳提取工藝提取的蘆丁和槲皮苷含量遠(yuǎn)高于其他工藝，因此，盡管未檢出槲皮素也不影響此提取工藝的可行性和科學(xué)性。

4 結(jié)論

辣蓼黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶20、乙醇濃度80%、加熱提取3次、每次提取2 h。該方法辣蓼黃酮提取率高且成本相對較低，可為辣蓼黃酮的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。