李佳珣，張秋香，王瑞，趙建新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

許多乳桿菌的表面都包裹著一層蛋白質(zhì)，即表層蛋白。攜帶此類蛋白的乳桿菌有嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌、格氏乳桿菌、短乳桿菌、約氏乳桿菌等[1]。嗜酸乳桿菌是一類重要的益生菌，能緩解輪狀病毒腹瀉、腹瀉型腸易激綜合征及牛乳過敏等，主要通過定殖于宿主腸道、與致病菌競爭黏附位點(diǎn)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等機(jī)制實(shí)現(xiàn)其益生功能[2-3]。

表層蛋白不僅作為黏附因子幫助乳桿菌定殖于腸道，其對菌株的本身特性有很多影響，ABRAMOV等[4]構(gòu)建了4個(gè)嗜酸乳桿菌表層蛋白突變體，在存在酒精、膽鹽等環(huán)境脅迫的條件下4個(gè)突變體的生長速度有顯著差異，這表明表層蛋白的存在影響了嗜酸乳桿菌在不良環(huán)境中的生長。同時(shí)，表層蛋白的剝離使嗜酸乳桿菌的黏附性降低，且剝離后的乳桿菌菌量降低1～2個(gè)對數(shù)級[5]，表明其生長狀態(tài)受到表層蛋白剝離的影響，而菌體的生長狀態(tài)與代謝水平息息相關(guān)。

近年來，為更加深入地了解表層蛋白的特性以推動(dòng)其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，許多研究從基因水平[6]、蛋白質(zhì)水平[7]等方面闡述了乳桿菌表層蛋白特性，而在代謝水平上，表層蛋白對嗜酸乳桿菌的影響尚不清楚。非靶向代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用于分析生物個(gè)體的代謝狀態(tài)，它可以對生物系統(tǒng)的各種生化代謝物進(jìn)行輪廓分析，其主要基于核磁共振波譜儀(nuclear magnetic resonance spectrometer，NMR)、GC-MS、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等平臺(tái)[8]。目前，對于嗜酸乳桿菌NCFM表層蛋白的研究較為廣泛且深入，在了解其氨基酸組成的基礎(chǔ)上，本研究擬通過基于GC-MS的非靶向代謝組學(xué)揭示嗜酸乳桿菌NCFM表層蛋白對嗜酸乳桿菌的自聚集能力、菌體生長、代謝產(chǎn)物等特性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜酸乳桿菌NCFM，美國菌種保藏中心，由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.2 試劑與儀器

甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)，Merck KGaA，吡啶溶液(99%)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷[N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide+1% trimethylchlorosilane, MSTFA+1%TMCS]、甲氧胺鹽酸鹽(methoxyamine hydrochloride，MeOX)，Sigma，LiCl(分析純)，國藥滬試。

Trace 1310-TSQ8000氣質(zhì)聯(lián)用儀、真空干燥機(jī)，Thermo公司；高通量組織破碎儀，新芝；酶標(biāo)儀，ThermoFisher；干式恒溫金屬浴，杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳桿菌的培養(yǎng)

取出-80 ℃保藏的菌種，以2%的接種量接種于 5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng) 18 h?；罨?代后可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 表層蛋白的去除

參考JOHNSON等[9]的方法并做適當(dāng)改動(dòng)。培養(yǎng)好的菌液于室溫下6 000×g離心15 min，收集菌體。向菌體中加入原乳桿菌培養(yǎng)液1/20體積的5 mol/L LiCl溶液并置于恒溫?fù)u床(37 ℃，220 r/min)處理2 h后，于室溫下12 000 ×g離心15 min。棄上清液,得到的菌體即為去除表層蛋白的乳桿菌，空白對照組以生理鹽水代替。

1.3.3 乳桿菌的生長及自聚集能力測定

將去除表層蛋白和對照組的乳桿菌以2%的接種量接種于 5 mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為108CFU/mL,記錄其OD值為A0，將菌懸液渦旋振蕩約10 s，室溫靜置4 h，上清液的OD600nm記為A4，按如下公式計(jì)算自聚集率[10]。

1.3.4 胞內(nèi)代謝物的提取

將1.3.2收集的菌體置于1.5 mL EP管中，迅速放入液氮中淬滅，置于-80 ℃冰箱備用。加入400 μL預(yù)冷的提取劑[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]，再加入100 μL的小磁珠，放在預(yù)冷的模塊中，以高通量組織破碎儀破碎。高通量組織破碎儀參數(shù)設(shè)置為破碎45 s，停15 s，循環(huán)10次。破碎后于4 ℃以12 000×g離心15 min，收集提取液，并轉(zhuǎn)移至新的離心管中。每個(gè)樣品取300 μL上清液放入真空濃縮儀，于45 ℃，0.1 kPa干燥1.5 h，得到干燥不含水的代謝組樣品[11]。為確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每組設(shè)置6個(gè)平行。

1.3.5 代謝物的衍生化

加入100 μL的0.1 mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，渦旋振蕩30 s，于37 ℃干式恒溫金屬浴90 min，然后加入40 μL的MSTFA試劑(含1% TMCS)，37 ℃金屬浴30 min[12]。室溫12 000×g離心15 min，吸取100 μL上清液至內(nèi)襯管中，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS條件

掃描的質(zhì)量數(shù)為33～600m/z，離子源類型為EI源，程序升溫：起始溫度為70 ℃，以5 ℃/min 的升溫速率提高至 230 ℃，后以90 ℃/min的升溫速率提高至 320 ℃，在此條件下維持5 min；載氣(He)流速1 mL/min；電子電離能量：70 eV；柱子型號(hào)為 RTX-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)[11]。

1.3.7 數(shù)據(jù)采集與分析

使用氣質(zhì)聯(lián)用儀對胞內(nèi)代謝物進(jìn)行檢測分析，使用AbfConverter.4.0.0軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，用MS-DIAL 4.3.8 軟件對所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行峰提取、保留時(shí)間校正、峰對齊等處理得到包括胞內(nèi)代謝物的質(zhì)譜信息、峰面積和保留時(shí)間等相關(guān)數(shù)據(jù)，用MS-DIAL4.3.8軟件配置的DB_FiehnBinbase-FiehnRI數(shù)據(jù)庫[13]進(jìn)行化合物的鑒定。將得到的歸一化后的峰面積數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入metaboanalyst 4.0[14]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及代謝通路分析，使用R包PCAtools,DESeq2,ggplot2等進(jìn)行可視化。結(jié)合T檢驗(yàn)尋找差異代謝物和計(jì)算顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌自聚集及生長特性

5 mol/L的氯化鋰溶液可以去除菌體表面超過90%的表層蛋白，且不會(huì)導(dǎo)致菌體失活[15]，故本研究采取該方法以去除表層蛋白。乳桿菌的生長和自聚集率變化如表1所示。嗜酸乳桿菌NCFM自聚集率變化則隨表層蛋白的去除有顯著下降，表明表層蛋白在嗜酸乳桿菌NCFM的黏附性上起重要作用，這也與文獻(xiàn)報(bào)道相符合[16]。LiCl處理后嗜酸乳桿菌生長終濃度比對照組低，我們推測表層蛋白的去除會(huì)造成乳酸菌胞內(nèi)氨基酸含量的降低，而氨基酸的重新合成，需要糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑過程中產(chǎn)生的能量，故影響菌體的正常生長和代謝，導(dǎo)致生長速率降低[17]。

表1 嗜酸乳桿菌對照組、氯化鋰處理組自聚集率變化及生長情況變化Table 1 The self-aggregation rate and growth of Lactobacillus acidophilus in control, treated with lithium chloride

2.2 乳桿菌胞內(nèi)代謝物分析

采用基于GC-MS的代謝組學(xué)分析技術(shù)，測定表層蛋白去除與否對乳酸菌胞內(nèi)代謝物的影響，并用主成分分析(principal component analysis，PCA)對胞內(nèi)代謝物進(jìn)行輪廓分析，結(jié)果如圖1-A所示。本次試驗(yàn)中，使用 PCA 模型可以取得較好的擬合效果，模型的PC1和PC2分別為53%和26.9%，滿足數(shù)據(jù)的擬合要求。從圖1-A可看出，表層蛋白的去除對乳酸菌胞內(nèi)代謝有顯著影響，處理組與對照組的樣本在得分圖上可以較好的分開，并且組內(nèi)的6個(gè)樣本點(diǎn)具有較好的統(tǒng)一性。

與PCA相似，偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)也是目前代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中最常使用的一種分類方法，為有監(jiān)督的分析方法，它在降維的同時(shí)結(jié)合了回歸模型[18]，可以結(jié)合判別閾值VIP(variable important in projection)值化合物進(jìn)行差異分析，便于尋找差異代謝物。PLS-DA的結(jié)果如圖1-B所示。2組的樣品各居一側(cè)，區(qū)分效果明顯，說明表層蛋白的去除對乳桿菌細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生影響，胞內(nèi)的小分子代謝物存在差異。

A-PCA得分圖；B-PLS-DA結(jié)果圖圖1 GC-MS分析嗜酸乳桿菌NCFM對照組和氯化鋰處理組2組樣品的PCA得分圖和PLS-DA結(jié)果圖Fig.1 The analysis results in GC-MS of the PCA and PLS-DA between two groups of samples of Lactobacillus acidophilus control and treated with lithium chloride

PLS-DA分析顯示有組分類和成對判別，模型中的VIP值大于1的化合物表示對2組的分離具有顯著貢獻(xiàn)[18]，在該P(yáng)LS-DA模型中鑒別出13個(gè)投影值(VIP值)大于1的差異代謝物，如圖2-A所示。結(jié)合VIP值、Fold Change和P值進(jìn)行差異代謝物的篩選，為直觀地表現(xiàn)出代謝物的差異情況，以及顯示2組樣品之間的總體模式特征，對差異代謝物繪制了火山圖(圖2-B)和聚類熱圖(圖2-C)。由圖2-A可知，乳酸的VIP值很高，表明乳酸含量在兩組間差異顯著(圖2-A)。同時(shí)，多種有機(jī)酸、部分糖類物質(zhì)的含量隨表層蛋白的缺乏而表現(xiàn)出顯著的變化。乳桿菌降解葡萄糖，發(fā)生糖酵解過程產(chǎn)生丙酮酸，乳酸脫氫酶會(huì)將丙酮酸還原為乳酸，乳酸作為乳桿菌糖代謝過程中的重要終產(chǎn)物[19]，在去除表層蛋白后乳酸積累增加。這與蘋果酸、烯醇式丙酮酸等物質(zhì)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢相一致，說明表層蛋白的缺乏可能使乳酸菌需要更加旺盛的糖代謝，以滿足氨基酸合成及菌體自身生長代謝所需要的能量，此時(shí)氨基酸合成會(huì)競爭生長所需要的能量[17]。從火山圖(圖2-B)可以看出，GC-MS鑒定到129種已知的化合物，其中15種代謝物|log2FoldChange|>1，為顯著差異代謝物。在聚類熱圖(圖2-C)中，多種氨基酸、有機(jī)酸、糖有顯著差異，這可能與氨基酸合成和能量代謝密切相關(guān)。

A-VIP得分圖；B-差異代謝物火山圖；C-差異代謝物熱圖圖2 嗜酸乳桿菌NCFM對照組和氯化鋰處理組2組樣品差異代謝物，VIP得分圖，差異代謝物火山圖，差異代謝物熱圖Fig.2 Different metabolites between two groups of Lactobacillus acidophilus control and lithium chloride treatment, VIP score plot, volcano of different metabolites, heatmap of different metabolites

乳桿菌的表層蛋白等電點(diǎn)偏堿性，其原因是帶正電荷的氨基酸遠(yuǎn)高于帶負(fù)電荷的氨基酸。同時(shí)表層蛋白中帶羥基的氨基酸含量也比較高，占比為 23.0%～33.0%[20]。從聚類熱圖(圖2-C)可以看出，其中的鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸呈下調(diào)趨勢，以其峰面積表示相對含量，對其進(jìn)一步進(jìn)行T檢驗(yàn)，如圖3-B～圖3-D所示，分析2組樣品這3種氨基酸含量具有顯著差異。鳥氨酸為一種堿性氨基酸，為精氨酸分解而成的產(chǎn)物，而組氨酸為帶正電的氨基酸，嗜酸乳桿菌fb116， 嗜酸乳桿菌fb214的表層蛋白分別含有3.99、4.82 mg/g的組氨酸[21]。酪氨酸是一種含有酚羥基的芳香族極性α-氨基酸，嗜酸乳桿菌fb116，嗜酸乳桿菌fb214分別含有4.26、6.12 mg/g的酪氨酸[21]。它們?yōu)榻M成乳桿菌表層蛋白的氨基酸，在5 mol/L的氯化鋰溶液處理后含量降低，而重新合成氨基酸需要時(shí)間積累，故含量顯著低于對照組。

c-對照組；t-氯化鋰處理組A-乳酸；B-組氨酸；C-鳥氨酸；D-酪氨酸圖3 嗜酸乳桿菌NCFM對照組、氯化鋰處理組2組樣品部分差異代謝物Fig.3 Different metabolites between two groups of Lactobacillus acidophilus control and lithium chloride treatment

2.3 代謝通路分析

對VIP>1或|log2FoldChange|>1的差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，如圖4所示，結(jié)果表明精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸的生物合成、精氨酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝這5條代謝通路得到了顯著富集，其P<0.1，這表明去除表層蛋白后的一段時(shí)間內(nèi)，氨基酸相關(guān)代謝十分活躍，這也暗示菌體的表層蛋白又在重新合成。這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的表層蛋白去除后過一段時(shí)間又可以在菌體上檢測到表層蛋白的現(xiàn)象一致[22]。乳桿菌的表層蛋白總氨基酸含量約為36%，其中，酸性氨基酸含量約為15%，稍低于堿性氨基酸含量[20]。賴氨酸最為常見合成表層蛋白的堿性氨基酸，約占10%。組氨酸、精氨酸含量則相對較低。精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸的生物合成、精氨酸生物合成與表層蛋白組成的氨基酸合成密切相關(guān)，同時(shí)，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路也被富集到了，這與文獻(xiàn)報(bào)道表層蛋白中的酸性氨基酸包括丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸[23]相符合。

圖4 兩組樣品差異代謝物代謝通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of metabolic pathways of different metabolites between two groups

3 結(jié)論

本研究采用代謝組學(xué)分析技術(shù)研究表層蛋白對乳酸菌胞內(nèi)代謝的影響，結(jié)果表明表層蛋白缺乏對乳酸菌胞內(nèi)代謝輪廓有顯著影響。表層蛋白的去除對乳酸菌氨基酸代謝有顯著影響，胞內(nèi)氨基酸濃度的低水平使得菌株需要更多的能量以恢復(fù)表層蛋白，并有可能通過競爭能量和中間產(chǎn)物使三羧酸循環(huán)的效率下降，對乳酸菌的生長代謝產(chǎn)生影響，本研究結(jié)果為表層蛋白在菌體生長代謝過程中的作用提供理論指導(dǎo)。對于非靶向代謝組學(xué)鑒定到的化合物，具體功能和含量后續(xù)仍需通過化合物鑒定和HPLC等設(shè)備進(jìn)行更加精確的定量。