王雪，馮旭，賀付蒙，徐永清，袁強(qiáng)，李麗，劉丹，孔德興，李鳳蘭

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150030)

秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，我國(guó)的秸稈總量巨大，但綜合利用效率極低[1]。焚燒是處理秸稈的主要方式，但該方法不僅造成資源浪費(fèi)，同時(shí)導(dǎo)致大氣環(huán)境的嚴(yán)重污染[2-3]。秸稈中富含纖維素，通過降解纖維素使其轉(zhuǎn)化為新型能源能夠極大的緩解現(xiàn)階段的能源短缺和環(huán)境污染問題，但降解效率過低仍是現(xiàn)階段限制該項(xiàng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一[4]。纖維素具有微纖維組成的復(fù)雜、多層結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使纖維素具有較強(qiáng)的硬度且極難溶于水，纖維素酶也因不能進(jìn)入微纖維中纖維鏈的深處從而導(dǎo)致酶解效率較低[5]。因此，探索高效、簡(jiǎn)便的纖維素降解方法具有重要的實(shí)際價(jià)值。

現(xiàn)階段輔助纖維素降解的方式通常有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法及生物法[6]。在以上幾種方法中，前3種通常需要高溫或高壓，成本較高，而生物法通常在常溫下即能完成，成本低且無污染[7]。纖維素的水解是一個(gè)復(fù)雜的過程，自然界中能夠降解纖維素的生物通常具有包含纖維素酶在內(nèi)的多酶體系，包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖酶、β-葡萄糖苷酶等，這些酶能夠發(fā)揮協(xié)同作用，將纖維素降解為可溶性多糖[8]。然而，生物法降解纖維素所需的時(shí)間仍然較長(zhǎng)，且效率不高。因此，迫切需要高效降解纖維素的微生物或者提高纖維素酶效率的添加劑[9]。

擴(kuò)展蛋白以非酶活性的作用方式發(fā)揮功能，即在不改變細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)構(gòu)的條件下，只通過破壞基質(zhì)多糖與纖維素微纖絲之間氫鍵的方式直接作用于細(xì)胞壁[10]。近些年的研究表明，擴(kuò)展蛋白能夠以協(xié)同蛋白的方式提高纖維素酶的水解效率，尤其是來自微生物中的擴(kuò)展蛋白[11-12]。來源于B.subtlis的擴(kuò)展蛋白BsEXLX1與纖維素酶混合協(xié)同作用于纖維素底物，其活力相比于單一纖維素酶提高了2～5.7倍[13]。來源于真菌A.fumigatus的擴(kuò)展蛋白AfSwol與內(nèi)切纖維素酶協(xié)同作用于底物羧甲基纖維素72 h后，水解活力提高了1.2倍[14]。因此，尋找高效、合適的擴(kuò)展蛋白對(duì)于提高纖維素降解效率和降低生產(chǎn)成本是非常必需的。

擴(kuò)展蛋白在天然生物體中的表達(dá)量較低，需要體外高效的表達(dá)系統(tǒng)以滿足生產(chǎn)需求。大腸桿菌通常用于外源蛋白的表達(dá)，然而植物及真菌的擴(kuò)展蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，重組蛋白會(huì)發(fā)生變性形成包涵體從而失活[15-16]。因此，本研究選擇了黑曲霉(Aspergillusniger)表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)冬小麥(Triticumaestivum)擴(kuò)展蛋白TaEXPA8，同時(shí)對(duì)該蛋白在纖維素水解中的作用進(jìn)行了初步探索，為植物擴(kuò)展蛋白在纖維素水解中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料及菌株

冬小麥“東農(nóng)冬麥1號(hào)”(Dongnongdongmai-1，DN-1)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans-T1感受態(tài)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL1感受態(tài)購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司，黑曲霉CICC2462由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑盒、酶及表達(dá)載體

RNA、DNA提取試劑盒(Easy Pure?)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Easy Script?)、高保真PCR酶(Trans Fast?)、pEASY-T3克隆載體，北京全式金生物科技有限公司；SDS-PAGE試劑盒，Thermo Fisher公司；限制性內(nèi)切酶ApaΙ和Hind Ⅲ、T4-DNA連接酶，NEB公司；pSZHGS表達(dá)載體由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 擴(kuò)展蛋白TaEXPA8基因的克隆

采用試劑盒對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)葉片中的總RNA進(jìn)行提取，1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量并測(cè)定濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，方法詳見說明書。通過PCR法獲得TaEXPA8基因的全長(zhǎng)，本試驗(yàn)所用引物如表1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接T3克隆載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中用于測(cè)序，同時(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行NCBI在線Blast分析。

表1 試驗(yàn)所用引物列表Table 1 List of primers used in the experiment

1.4 pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體的構(gòu)建

通過PCR法在TaEXPA8基因的上下游分別添加ApaΙ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)并切除信號(hào)肽，產(chǎn)物經(jīng)純化后備用。利用限制性內(nèi)切酶ApaΙ和Hind Ⅲ分別對(duì)上述PCR產(chǎn)物和pSZHGS表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后通過T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中用于測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化黑曲霉

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化方法參照李杰等[17]進(jìn)行，具體方法如下。將pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌AGL1中，方法詳見說明書，陽(yáng)性農(nóng)桿菌經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)行活化培養(yǎng)。分別取二次活化的農(nóng)桿菌菌液1.5 mL和適量的黑曲霉菌絲置于無菌EP管中，混合后涂布于鋪有玻璃紙的固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)(含200 μmol/L的乙酰丁香酮)，28 ℃共培養(yǎng)2 d 后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜培養(yǎng)，潮霉素及頭孢噻肟鈉為抗性篩選，提取陽(yáng)性菌落的DNA并進(jìn)行PCR鑒定。挑選鑒定結(jié)果正確的菌落于馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)6 d后取發(fā)酵液于50 mL離心管中，離心后取沉淀進(jìn)行RT-PCR鑒定以檢測(cè)TaEXPA8基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.6 TaEXPA8蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

取少量TaEXPA8黑曲霉工程菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)以檢測(cè)TaEXPA8蛋白的表達(dá)情況，操作方法詳見試劑盒說明書。

1.7 TaEXPA8工程菌的纖維素水解作用分析

采用濾紙崩解試驗(yàn)檢測(cè)TaEXPA8工程菌的纖維素水解作用，在纖維素酶液中分別添加等體積的TaEXPA8工程菌、野生型黑曲霉菌株的發(fā)酵上清液，以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。取10 mL上述液體分別添加到鋪有50 mg無淀粉濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃，2 d后取出濾紙于顯微鏡下觀察，同時(shí)采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測(cè)定體系中的葡萄糖含量[18]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

GraphPad Prism 5.0軟件用于差異顯著性分析及作圖，所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬小麥總RNA的提取

東農(nóng)冬麥1號(hào)植株葉片總RNA的電泳結(jié)果如圖1所示，28S、18S和5S條帶清晰，無降解現(xiàn)象，濃度的測(cè)定結(jié)果為(540±17)ng/μL，OD260/OD280為2.0±0.1。結(jié)果顯示RNA的純度較高，濃度適宜，可以用于下一步試驗(yàn)。

M-maker DL 2 000；1-RNA圖1 東農(nóng)冬麥1號(hào)葉片總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Results of total RNA electrophoresis from DN-1 leaves

2.2 TaEXPA8基因的克隆

以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板對(duì)TaEXPA8基因進(jìn)行克隆，電泳結(jié)果(圖2)顯示目的條帶大小在750～1 000 bp，與引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期的條帶大小一致，可以進(jìn)行測(cè)序。將PCR產(chǎn)物純化后連接至T3克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測(cè)序。NCBI的在線Blast分析結(jié)果(圖3)表明所獲得PCR產(chǎn)物與TaEXPA8基因的序列吻合度為99%，即已經(jīng)成功從東農(nóng)冬麥1號(hào)中獲得了TaEXPA8基因，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

M-maker DL 2 000；1-TaEXPA8基因克隆結(jié)果圖2 TaEXPA8基因的克隆結(jié)果Fig.2 Cloning results of TaEXPA8 gene

圖3 TaEXPA8基因測(cè)序結(jié)果的NCBI在線Blast分析Fig.3 NCBI online blast analysis of TaEXPA8 gene sequencing results

2.3 pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體的構(gòu)建

通過PCR在TaEXPA8基因的上下游分別添加ApaΙ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)并切除信號(hào)肽。分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pSZHGS表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。對(duì)構(gòu)建好的pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果(圖4)表明TaEXPA8基因已經(jīng)成功插入pSZHGS表達(dá)載體的ApaΙ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)之間。

M1-maker DL 2 000；1-pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體的雙酶切結(jié)果；M2-maker DL 15 000圖4 pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體的雙酶切結(jié)果Fig.4 Results of double digestion of pSZHGS-TaEXPA8 expression vector

2.4 轉(zhuǎn)化pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體黑曲霉菌株的獲得

將pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌AGL1中，活化后的農(nóng)桿菌菌液與黑曲霉共培養(yǎng)(圖5)，并通過PCR分別在DNA和mRNA水平上對(duì)工程菌中的TaEXPA8基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖6。PCR的結(jié)果顯示已經(jīng)在黑曲霉工程菌的DNA中檢測(cè)到TaEXPA8基因，RT-PCR的鑒定結(jié)果表明該擴(kuò)展蛋白基因在工程菌中能夠正常的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

圖5 轉(zhuǎn)化pSZHGS-TaEXPA8表達(dá)載體的農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng)結(jié)果Fig.5 Co-culture of Agrobacterium transformed pSZHGS-TaEXPA8 expression vector with Aspergillus niger

圖6 TaEXPA8黑曲霉工程菌的鑒定結(jié)果Fig.6 Identification results of TaEXPA8 engineered Aspergillus niger

2.5 TaEXPA8蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

通過SDS-PAGE檢測(cè)黑曲霉工程菌發(fā)酵上清液中TaEXPA8蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示。TaEXPA8蛋白的分子質(zhì)量約為25 kDa，相比于野生型菌株，工程菌在相應(yīng)的位置處有條帶出現(xiàn)，但不明顯。由此可見TaEXPA8蛋白已經(jīng)表達(dá)，但表達(dá)量較低。

M-蛋白質(zhì)marker；1-培養(yǎng)基上清液；2-野生型菌株發(fā)酵上清液；3-TaEXPA8重組菌株發(fā)酵上清液圖7 TaEXPA8蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE results of TaEXPA8 protein

2.6 TaEXPA8工程菌的纖維素水解作用分析

濾紙的崩解試驗(yàn)結(jié)果如圖8-A所示，相比于空白對(duì)照和纖維素酶液的單獨(dú)處理，TaEXPA8重組菌株的上清液能夠顯著促進(jìn)纖維素酶發(fā)揮功能，濾紙的崩解程度較高。葡萄糖含量的測(cè)定結(jié)果也進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)。對(duì)照組中葡萄糖的含量為0.064 mg/mL，添加TaEXPA8工程菌上清液的處理組相比于對(duì)照增加了21.2%，差異顯著(圖8-B)。

A-TaEXPA8工程菌發(fā)酵上清液的濾紙崩解作用分析；B-濾紙崩解體系中葡萄糖的含量圖8 TaEXPA8黑曲霉工程菌的纖維素水解作用分析結(jié)果Fig.8 Cellulose hydrolysis analysis results of TaEXPA8 engineered Aspergillus niger注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

纖維素在自然界中的存量非常大，通過降解纖維素生產(chǎn)乙醇是現(xiàn)階段可行的能源替代方案，但尋求高效的降解方法仍是目前亟待解決的關(guān)鍵難題。生物法降解纖維素相比于傳統(tǒng)的方法具有很多優(yōu)勢(shì)，但仍需要高效的酶系統(tǒng)以提高降解效率。多項(xiàng)研究顯示，擴(kuò)展蛋白能夠協(xié)同纖維素酶發(fā)揮功能并提高水解效率。原理為擴(kuò)展蛋白在破壞纖維素微纖絲之間氫鍵的同時(shí)增強(qiáng)了纖維素基質(zhì)的表面積，進(jìn)而提高了纖維素酶的吸附能力，從而使水解效率上升。在纖維素酶解時(shí)添加少量的擴(kuò)展蛋白可以顯著提高纖維素酶的活性，從而減少所需的總酶負(fù)載[19]。在本研究中，TaEXPA8工程菌的上清液顯著促進(jìn)了纖維素酶處理下濾紙的崩解，葡萄糖的測(cè)定結(jié)果也顯示水解效率顯著增加。結(jié)果表明，除了微生物中的擴(kuò)展蛋白外，來自于冬小麥的擴(kuò)展蛋白TaEXPA8在纖維素降解過程中也具有相同的功能，這為尋找高效降解纖維素的擴(kuò)展蛋白提供了新的思路。

植物擴(kuò)展蛋白的異源表達(dá)是非常困難的，直到2014年才首次實(shí)現(xiàn)來自于番茄(Lycopersiconesculentum)的擴(kuò)展蛋白LeEXP2在畢赤酵母(Pichiapastoris)中有活性的表達(dá)，但最大表達(dá)量?jī)H為71 mg/L[20]。尋找合適的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和活性至關(guān)重要。在本研究中，RT-PCR的結(jié)果顯示，TaEXPA8基因在工程菌中的轉(zhuǎn)錄水平較高，但SDS-PAGE的結(jié)果卻顯示蛋白的表達(dá)水平較低。在類似的研究中，目標(biāo)基因多來自于微生物中，作為來自高等植物中的TaEXPA8可能與黑曲霉的表達(dá)系統(tǒng)不相適應(yīng)，猜測(cè)這可能是蛋白表達(dá)水平較低的原因之一，更換表達(dá)載體或者對(duì)該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化可能是有效的解決方案。TaEXPA8工程菌的上清液使纖維素酶的水解效率提高了21.2%，對(duì)于純化的TaEXPA8蛋白，這一效率可能會(huì)更高，表明該蛋白具有潛在的應(yīng)用前景。本研究對(duì)植物擴(kuò)展蛋白在纖維素降解過程中的作用進(jìn)行了新的嘗試，雖然工程菌的產(chǎn)量較低，但對(duì)后續(xù)的相關(guān)研究也具有一定參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究從冬小麥中克隆了擴(kuò)展蛋白基因TaEXPA8，并構(gòu)建了表達(dá)TaEXPA8蛋白的黑曲霉工程菌。工程菌的發(fā)酵液能夠顯著促進(jìn)纖維素酶的水解效率，但TaEXPA8蛋白的產(chǎn)量較低。同微生物中擴(kuò)展蛋白的功能相似，本研究揭示了來自于植物中的擴(kuò)展蛋白在協(xié)同纖維素生物降解過程中也具有積極作用，但異源高效表達(dá)植物擴(kuò)展蛋白的方法還需進(jìn)一步的研究以獲得，如何提高擴(kuò)展蛋白的產(chǎn)量及純度等工作仍是后續(xù)研究的重點(diǎn)。